恒温条件下地西泮对肥须亚麻蝇幼虫的影响及法医学意义

【摘要】 目的：研究石家庄地区优势蝇种肥须亚麻蝇在地西泮作用下生长发育的变化情况，探索多项实验指标随时间的规律性变化，积累生物学资料，从而为刑事调查中死后间隔时间的推断和法医昆虫毒理学提供参考依据。方法：在河北医科大学校园内以动物内脏诱捕肥须亚麻蝇，带回实验室在生化培养箱内连续饲养至第三代，并以第三代作为母代观察其在地西泮影响下的生长发育。本实验使用家兔4只，随机分为对照组和实验组。对照组家兔经耳缘静脉注射生理盐水1ml/kg，实验组家兔经耳缘静脉依次注射1/2倍，1倍，2倍致死剂量的地西泮，给药30min后以重击家兔枕部的方法将4只家兔处死。取家兔肌肉组织分别保存，对照组标记为M0，实验组依照给药浓度从小到大依次标记为M1、M2、M3。设定生化培养箱温度为28℃，相对湿度为75％，光照周期为12h:12h。用新鲜猪肉诱肥须亚麻蝇产卵，产卵时间记为零时，将卵块移至家兔的肌肉组织上饲养。幼虫产出12小时后，每隔12小时留取标本一次，每组每次留取10头幼虫，直至幼虫达到离食期。将每组每次留取的10头幼虫用80℃热水烫死，然后放入浓度为70％的酒精中保存。头咽骨、体长、体重的形态学观察及测定从保存液中取出幼虫标本后，吸干表面液体，放在培养皿上，用大头针在幼虫腹部一侧扎几个小孔，放入10％的KOH溶液中消化内部组织，24h后将幼虫从KOH溶液中取出，放在培养皿上用镊子轻轻按压幼虫，直至将体内已消化的组织排出。幼虫在清水中洗净数遍后，在体式显微镜下分离出幼虫头节，然后将头咽骨进行对称分离标本依次用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％的酒精中逐级脱水，最后用二甲苯透明，显微镜下整姿后滴加加拿大树胶封片，置于阴凉处风干。用千分尺测量幼虫的体长，用电子天平测量幼虫的体重。光学显微镜下观察、拍照。利用计算机图像分析系统对头咽骨的口钩及咽骨的面积、骨化面积和平均光密度等多项指标进行测定。各组头咽骨的各项形态学指标及体长、体重均采用均数±标准差表示，各组最大值或最小值间比较应用单因素方差分析，分析结果由SPSS16.0软件处理得出，以P<0.05为显著性差异有统计学意义，应用Excel程序作图。结果:1幼虫头咽骨形态的变化1.1在恒定温度（28℃）下随着肥须亚麻蝇幼虫的生长发育，其头咽骨的颜色逐渐由1龄期的淡黄色变为2龄期的棕褐色，最后变为3龄期的黑褐色，几丁质化程度不断加强，骨化的范围不断增大。在三龄期可见点状的附口骨。1.2在恒温（28℃）条件下，M0、M1、M2、M3四组中肥须亚麻蝇幼虫的口钩面积随着时间的延长表现出阶段性增加的特点，龄期更替时变化最明显。当幼虫的口钩面积达到最大值后，随着时间的延长基本维持不变。12h时,各组幼虫口钩面积最小，最小值之间有明显差异，具有统计学意义（P<0.05，见Fig.6）。各组幼虫口钩面积的最大值之间无明显差异，不具有统计学意义（P>0.05）。其中M0于48h达最大口钩面积，M1、M2、M3均于36h达最大口钩面积。幼虫口钩骨化面积和口钩平均光密度的变化趋势与口钩面积的变化趋势相似，各组幼虫口钩骨化面积和平均光密度均随着时间的延长而增加，进入三龄期达最大值后基本维持不变。12h时，各组幼虫口钩骨化面积和口钩平均光密度均为最小，且各最小值之间有明显差异，具有统计学意义（P<0.05）。各组最大值之间无明显差异，不具有统计学意义（P>0.05，见Fig.7，见Fig.8）。其中M0于96h到达最大口钩骨化面积和口钩平均光密度，M1于84h到达最大值,M2、M3均于72h达到最大值。1.3在恒温（28℃）条件下，M0、M1、M2、M3组中幼虫咽骨面积增长趋势与口钩面积增长趋势相同，呈阶段性增加，表现为在龄期内增加速度平缓，在龄期更替时增长速度显著增快。当咽骨面积达到最大值后，基本维持不变。12h时，各组幼虫咽骨面积为最小，最小值之间有明显差异（P<0.05），具有统计学意义。而各组咽骨面积最大值之间无明显差异，不具有统计学意义（P>0.05，见Fig.3）。其中M0于48h达最大咽骨面积，M1、M2、M3均于36h达最大咽骨面积。各组幼虫咽骨骨化面积和咽骨平均光密度在1龄初期较小，随着时间的延长逐渐增大，直至3龄期结束。各组幼虫产出12h时咽骨骨化面积和咽骨平均光密度均为最小，且各最小值之间有明显差异，具有统计学意义（P<0.05）。各组最大值之间无明显差异，不具有统计学意义（P>0.05，见Fig.4，见Fig.5）。其中M0于120h到达最大咽骨骨化面积和咽骨平均光密度，M1于96h到达最大值,M2、M3均于84h达到最大值。2幼虫体长体重的变化2.1在恒温（28℃）条件下，M0、M1、M2、M3组中幼虫体重随着时间的延长逐渐增加，当体重达到最大值后随时间的延长基本维持不变。各组幼虫产出12h时开始采集标本，在36h时，各组幼虫平均体重出现显著差异（P<0.05）,各组幼虫到达最大体重的时间依次为96h,84h,72h,72h。各组幼虫体重最大值之间有明显差异，具有统计学意义（P<0.05）。其大小依次为M3>M2>M1>M0。幼虫体长的变化趋势与体重的增长趋势相似，各组幼虫体长随时间延长平缓增长，进入三龄期达最大值后出现一定幅度的减小，之后基本维持不变。各组幼虫于产出12h时开始采集标本，在48h时，各组幼虫平均体长有明显差异（P<0.05），各组幼虫到达最大体长的时间为96h,84h,72h,72h。各组幼虫体长最大值之间有明显差异，具有统计学意义（P<0.05）。其大小依次为M3>M2>M1>M0。结论：1幼虫体重、体长随时间的延长呈现出平缓的增长趋势，当达最大值后，基本保持不变。在四个实验组中，随着地西泮药物浓度的增大幼虫达最大体长、体重的时间逐渐缩短，说明地西泮对幼虫的生长发育有促进作用。2幼虫口钩的面积、平均光密度和骨化面积随时间的延长而增加，龄期更替时变化显著，但进入三龄期达到最大值之后基本维持不变。地西泮对口钩各项指标的最大值没有明显影响。3幼虫咽骨面积的变化趋势与口钩面积的变化趋势相同。但咽骨的骨化面积和咽骨平均光密度在进入三龄期后仍在稳定持续的增长，直至三龄期结束，因此咽骨的骨化面积和平均光密度更适合用于日龄的推测。地西泮对咽骨各项指标的最大值没有明显影响。 

前     言 

通过研究我们发现蝇类幼虫的头咽骨能够反映幼虫在生长发育过程中的变化规律，且与体长体重等其它指标相比，头咽骨具有更好的稳定性。王玲[1]曾对肥须亚麻蝇幼虫的气门及头咽骨进行了研究，她指出肥须亚麻蝇幼虫咽骨的骨化面积和咽骨平均光密度均随着幼虫日龄的增加呈现出规律性的变化。既往的相关研究都可以刑事案件中死后间隔时间（PMI）的推断提供理论依据。本次试验选用的肥须亚麻蝇是石家庄地区的优势蝇种。它分布广泛，较易捕获切繁殖力强，是法医昆虫学侦破案件中应用较多的蝇种。试验以肥须亚麻蝇幼虫的头咽骨为研究对象，通过测定头咽骨的面积、骨化面积、平均光密度来建立在地西泮影响下，各项指标和幼虫发育时间的关系，为利用法医昆虫学推断死后间隔时间（PMI）提供有力的理论指导。
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1材料与方法 

1.1实验材料
在河北医科大学校园内以瘦猪肉诱捕肥须亚麻蝇，带回实验室饲养。蝇种鉴定按照《中国蝇类检索表》系统进行分类。将肥须亚麻蝇置于养蝇笼内，饲以纯净水、奶粉、白砂糖（奶粉：糖＝1:1）。养蝇笼置于生化培养箱内，温度设定为 28℃，湿度为 75％，光照为 12:12 小时。每天换水一次，及时添加饲料，连续饲养至第三代成蝇作为母蝇开始试验。地西泮的最大注射剂量为50mg／60kg，根据“人和动物按体表面积折算的等效最大用量”计算出家兔的致死剂量为 20mg／kg，根据此剂量分别设定家兔的注射剂量为1/2 倍致死剂量、1 倍致死剂量、2 倍致死剂量。

1.2肥须亚麻蝇的饲养
在 28℃恒温条件下用瘦猪肉诱成蝇产卵，将切成2cm×2cm×2cm 的小块，中间切开，置于 50ml 的烧杯中，放进养蝇笼。每间隔30min 收集一次产有虫卵的卵块，将卵块从养蝇笼内取出并放入装有不同浓度的家兔肌肉的烧杯中，标明产卵时间。将这4 只烧杯置于盛有沙子的大烧杯中，保证幼虫生长过程中食物充足。将幼虫标本从70%的酒精保存液中取出，放在表面皿上。用大头针在幼虫腹部两侧扎数个小孔，然后放入 10%的KOH 溶液中消化。待幼虫在KOH 消化液中充分消化 24 小时后，将幼虫取出，再次放在表面皿上，使用镊子轻压幼虫体部，将体内已消化的组织排出。将幼虫在纯净水中洗净，依次放入 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中逐级脱水，每级 20min，然后将经过 9 级脱水的幼虫在 100%的酒精与二甲苯的混合液（比例为 1:1）浸泡 20min，放入二甲苯中透明。将透明好的幼虫放置在载玻片上，滴加加拿大树胶，在解剖镜下将标本整姿，盖上盖玻片，置于阴凉处风干。

前言…………………………………9
1材料与方法………………………………9
1.1实验材料……………………………………9
1.2肥须亚麻蝇的饲养…………………10
2结果.……………………11
附图.………………………15
3讨论.……………………24
3.1地西泮对肥须亚麻蝇体长体重的影响………………………………23

3.2地西泮对肥须亚麻蝇头咽骨的影响………………………………25

4结论.…………………………26

3讨     论 

3.1地西泮对肥须亚麻蝇体长体重的影响
在 28℃的恒温条件下，肥须亚麻蝇幼虫的体重随幼虫生长时间的延长逐渐增加，当体重达最大值后随幼虫生长时间延长基本维持不变。M0、M1、M2、M3各组幼虫在36h 时，各组幼虫平均体重出现显著差异（P<0.05）,各组幼虫到达最大体重的时间依次为96h,84h,72h,72h。各组幼虫体重最大值之间差异明显，具有统计学意义（P<0.05）。其大小依次为 M3>M2>M1>M0。在 28℃的恒温条件下，肥须亚麻蝇幼虫的体长随幼虫生长时间的延长逐渐增加，当体长达最大值后随幼虫生长时间延长出现一定幅度减小，之后基本维持不变。M0、M1、M2、M3各组幼虫于孵出 12h 时开始采集标本，在 48h 时，各组幼虫平均体长出 现 显 著 差 异 （ P<0.05 ）， 各 组 幼 虫 到 达 最 大 体 长 的 时 间 为96h,84h,72h,72h。各组幼虫体长最大值之间差异明显，具有统计学意义（P<0.05）。其大小依次为 M3>M2>M1>M0。由以上数据可知，地西泮增快了肥须亚麻蝇幼虫的生长速度，同时增大了体长体重的最大值，且随着地西泮浓度越大，幼虫体长体重达最大值的时间越短，极值越大。

3.2地西泮对肥须亚麻蝇头咽骨的影响
12h 时，四个实验组幼虫的口钩面积最小，各组的最小值之间差异明显，具有统计学意义（P<0.05，见Fig.1）。其中 M0于48h 达最大值、M1、M2、M3均于 36h 达最大值。由实验结果可知地西泮使口钩面积达到最大值的时间缩短，也就是说地西泮增快了幼虫的生长发育速率。口钩骨化面积及口钩平均光密度变化趋势相似，其中 M0于96h 达最大值、M1于84h达最大值、M2、M3均于 72h 达最大值。说明地西泮的作用浓度与肥须亚麻蝇幼虫的生长发育速度呈正相关。同时我们看到，上述各实验组中的口钩面积、口钩骨化面积、口钩平均光密度各自的最大值并没有因为地西泮作用浓度的不同出现明显的差异，这说明地西泮对肥须亚麻蝇幼虫口钩各项指标的最大值没有产生影响。
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结     论

1  地西泮增加了肥须亚麻蝇幼虫生长发育的速度，在一定范围内，随药物浓度的增加，生长速度增快程度越大。同时地西泮增加了幼虫体长、体重的最大值，笔耕文化推荐期刊，由此可知幼虫体长、体重稳定性差，不宜作为死后间隔时间推断的观测指标。
2  地西泮对幼虫头咽骨各观测指标的最大值没有影响，说明肥须亚麻蝇头咽骨的稳定性好，是推断死后间隔时间的可靠依据。
3  肥须亚麻蝇幼虫在进入 3  龄期之后，口钩面积、口钩骨化面积、口钩平均光密度、咽骨面积快速达到最大值后基本维持不变，而咽骨的骨化面积、平均光密度进入3 龄期后仍持续增长直至 3 龄期末。因此，咽骨的骨化面积和咽骨平均密度更适合幼虫日龄的推算，也更适合作为死后间隔时间推断的观测指标。 
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