桂郁金SSR-PCR反应体系的建立及优化

发布时间：2024-03-24 05:10

　　目的:对桂郁金SSR-PCR反应体系进行建立与优化,使其适合分析桂郁金遗传多样性等研究内容。方法:通过正交设计法对PCR反应体系的引物,模板,2×Taq PCR MasterMix(包括Tap DNA聚合酶,dNTPs,缓冲液等)以及扩增程序进行建立和优化。结果:桂郁金SSR-PCR反应的最佳体系是在15μL的反应体系中,DNA模板2.5μL (25 ng·μL^-1),引物1.0μL(1.0μmol·L^-1),2×Taq PCR MasterMix6μL,其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL^-1,Mg²⁺3.0 mmol·L^-1,dNTPs0.3 mmol·L^-1,加ddH₂O至15μL。PCR反应程序的最佳参数设定为变性30 s,退火30 s,延伸45 s,循环35次。结论:建立了桂郁金SSR-PCR反应体系,并通过10份桂郁金材料进行验证,结果显示该体系稳定可靠,可以为桂郁金引物开发,良种选育繁育等相关研究提供参考。

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【部分图文】：

图1桂郁金SSR-PCR反应体系L9(33)正交设计试验扩增效果

对实验建立的9个不同组合进行分析与优化,由于模板,引物以及MIX含量的不同,结果差异明显。如图1所示。9个组合均能扩增出条带,5,7,8,9反应体系扩增得到的条带弱,特异性差,2,3,4,6反应体系扩增得到的条带较清晰,其中反应体系4条带多,特异性最好。即在15μL体系中,DNA....

图2桂郁金SSR-PCR反应程序L16(44)正交设计试验扩增效果

对实验所建立的16组SSR-PCR反应程序的不同组合进行分析与优化,结果如图2所示。组合条件的不同导致了扩增条带的差异。表现为条带的颜色深浅不同,效果存在着较大区别。组合2,13,14条带较浅,稳定性也较差,反应体系不理想,综合实验结果,反应程序10条带清晰,稳定性较好,因此将反....

图3桂郁金不同退火温度扩增效果

退火温度的确定是利用以上确定的最佳反应体系及反应程序进行的,本梯度试验的范围是54.0～56.5℃。结果如图3所示。当温度低于54.5℃时,主带不清晰,且有许多较浅的杂带,当温度超过55.5℃时,条带的稳定性以及多态性下降。在退火温度为55℃时,条带的清晰度,稳定性等均较好,由此....

图410份桂郁金材料扩增效果

采用10份不同种质的桂郁金材料对优化得到的体系进行验证。扩增结果如图4所示,10份桂郁金材料均可以扩增出清晰、多态性高、重复性好的条带,由此也证明了该优化体系的合理性和适用性。4讨论

本文编号：3937018