USP2与USP24在血液肿瘤中作用及机制
发布时间：2024-04-13 01:07
利用活性的小分子化合物为探针发现重要的药物作用靶标,并解释细胞生命活动的规律是现代医学研究中有效策略。我们研究发现藤黄酸(gambogic acid,GA)在体内外均能够有效地抑制多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)细胞的存活与增殖。同时我们合成生物素标记GA(Biotin-GA)作为探针,利用一系列化学蛋白质组学技术开展其抗MM的化学生物学研究,研究结果发现GA可以直接靶向泛素特异性蛋白酶2a(USP2a)并高效抑制其酶活。接下来通过质谱分析与位点突变实验证实了USP2a的Cys284是GA的共价结合位点。此外,研究发现USP2a在MM中高表达且与生存期显著负相关,在MM细胞中敲低USP2a可显著抑制其体内外增殖。综上所述,我们的研究表明GA主要是通过别构抑制USP2a酶活发挥体内体外抗MM的效应,GA与USP2a作用的Cys284结合口袋有望为开发特异高效USP2a的抑制剂提供参考。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是由于未成熟T细胞祖细胞的致癌转化而引起的一种淋巴样恶性肿瘤,预后较差,急需新靶标的识别与发展新的药物来治疗这种疾病。WP1130是一种去泛素蛋白...
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
全文主要缩略语中英文对照表
第一部分 靶向USP2a抑制多发性骨髓瘤化学生物学研究
第一章:研究背景和问题的提出
1.1 USP2的分类、定位及结构
1.1.1 USP2 的分类与定位
1.1.2 USP2 蛋白结构
1.2 USP2 与疾病
1.2.1 USP2 与肿瘤
1.2.2 USP2 与炎症
1.2.3 USP2 与其他
1.3 USP2 抑制剂研究现状
1.4 本文主要研究内容概述
第二章:GA在体内体外均可抑制MM
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 实验动物
2.1.4 细胞培养
2.1.5 瑞氏染色
2.1.6 裸鼠移植瘤模型的建立
2.1.7 分组、给药方式及观察指标
2.1.8 免疫组化检测
2.2 结果
2.2.1 GA体外抑制MM效应
2.2.2 GA体内抑制MM移植瘤效应
2.3 小结与讨论
第三章:GA直接靶向USP2a
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 Pull-down实验验证GA与 USP2a体外相互作用
3.1.4 蛋白免疫印迹(Western blot)
3.1.5 GST-UBA52 蛋白的纯化
3.1.6 USP2a蛋白镍柱纯化
3.1.7 细胞热力学稳定性迁移分析实验(Cellular thermal shift assay, CETSA)
3.1.8 GA与 USP2a的亲和力常数(Kd)检测
3.1.9 应用GST-UBA52 为底物筛选对USP2a的化合物
3.1.10 细胞免疫荧光
3.2 结果
3.2.1 利用Biotin-GA Pull-down实验验证与USP2a直接作用
3.2.2 GA与 USP2a可在体外相互作用
3.2.3 GA可高效、选择性抑制USP2a酶活
3.2.4 GA细胞内靶向USP2a
3.3 小结与讨论
第四章:GA共价结合USP2a284 位半胱氨酸
4.1 材料与方法
4.1.1 USP2a与 GA的动力学结合常数
4.1.2 USP2a蛋白分子筛纯化
4.1.3 USP2a过 SP离子交换柱
4.1.4 USP2a质粒定点突变
4.1.5 结合口袋氨基酸位点突变
4.1.6 突变体的蛋白纯化与亲和力测试
4.1.7 USP2a晶体筛选
4.2 结果
4.2.1 GA共价结合到USP2a蛋白的Cys284 位点
4.2.2 USP2a与 GA结合的动力学特点
4.2.3 Cys284 口袋预测
4.2.4 USP2a晶体筛选优化
4.3 小结与讨论
第五章:USP2a在 MM中作用
5.1 材料与方法
5.1.1 主要试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 构建带有USP2 基因sgRNA和 Cas9 基因的表达质粒
5.1.4 单克隆挑取
5.1.5 质粒大量抽提
5.2 结果
5.2.1 USP2a在 MM中高表达且与生存期负相关
5.2.2 敲除USP2a抑制MM体外增殖
5.2.3 敲低USP2a后抑制MM体内移植瘤增殖
5.3 讨论
第六章:结语
第二部分 WP1130 靶向USP24 抑制T-ALL的机制研究
第一章 研究背景和问题的提出
1.1 T-ALL的研究进展
1.2 USP24 研究进展
1.3 本文主要研究内容概述
第二章 WP1130对T-ALL体外生物学效应研究
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 CCK-8 检测细胞增殖
2.1.4 骨髓标本单个核细胞分离
2.1.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡
2.1.6 Western blotting(蛋白印迹)
2.1.7 统计学分析
2.2 结果
2.2.1 WP1130 抑制T-ALL细胞增殖
2.2.2 WP1130 诱导T-ALL细胞凋亡
2.3 小结与讨论
第三章 USP24在T-ALL中作用研究
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 USP24与USP9X细胞敲除实验
3.1.4 荧光定量PCR
3.2 结果
3.2.1 敲低USP24 而不是USP9X可使T-ALL细胞凋亡
3.2.2 敲低USP9X可使USP24 表达上调
3.2.3 USP24在T-ALL中高表达并且与预后负相关
3.3 小结与讨论
第四章 WP1130 可在T-ALL细胞内与USP24 相互作用
4.1 材料与方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器
4.1.3 分子对接
4.1.4 细胞热力学稳定性迁移分析实验(CETSA)
4.2 结果
4.2.1 WP1130 可共价结合于USP24 活性中心
4.2.2 WP1130 可改变USP24 的热稳定性
4.3 小结与讨论
第五章 WP1130 通过USP24-Mcl-1 通路发挥作用
5.1 材料和方法
5.1.1 主要试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 细胞线粒体跨膜电位检测
5.1.4 dCas9-sgUSP24质粒构建
5.2 结果
5.2.1 WP1130 下调Mcl-1 并且引起线粒体跨膜电位损伤
5.2.2 WP1130 通过USP24-Mcl-1 通路引起细胞凋亡
5.3 小结与讨论
第六章 WP1130 抑制T-ALL体内实验
6.1 材料与方法
6.1.1 主要试剂
6.1.2 体内动物实验
6.2 结果
6.2.1 NOD-SCID小鼠一般情况
6.2.2 移植瘤生长情况
6.2.3 移植瘤免疫组化
第七章 讨论
参考文献
致谢
学术论文和科研成果目录
附录:在"Cancer Cell International”发表论文
本文编号：3952249
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
全文主要缩略语中英文对照表
第一部分 靶向USP2a抑制多发性骨髓瘤化学生物学研究
第一章:研究背景和问题的提出
1.1 USP2的分类、定位及结构
1.1.1 USP2 的分类与定位
1.1.2 USP2 蛋白结构
1.2 USP2 与疾病
1.2.1 USP2 与肿瘤
1.2.2 USP2 与炎症
1.2.3 USP2 与其他
1.3 USP2 抑制剂研究现状
1.4 本文主要研究内容概述
第二章:GA在体内体外均可抑制MM
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 实验动物
2.1.4 细胞培养
2.1.5 瑞氏染色
2.1.6 裸鼠移植瘤模型的建立
2.1.7 分组、给药方式及观察指标
2.1.8 免疫组化检测
2.2 结果
2.2.1 GA体外抑制MM效应
2.2.2 GA体内抑制MM移植瘤效应
2.3 小结与讨论
第三章:GA直接靶向USP2a
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 Pull-down实验验证GA与 USP2a体外相互作用
3.1.4 蛋白免疫印迹(Western blot)
3.1.5 GST-UBA52 蛋白的纯化
3.1.6 USP2a蛋白镍柱纯化
3.1.7 细胞热力学稳定性迁移分析实验(Cellular thermal shift assay, CETSA)
3.1.8 GA与 USP2a的亲和力常数(Kd)检测
3.1.9 应用GST-UBA52 为底物筛选对USP2a的化合物
3.1.10 细胞免疫荧光
3.2 结果
3.2.1 利用Biotin-GA Pull-down实验验证与USP2a直接作用
3.2.2 GA与 USP2a可在体外相互作用
3.2.3 GA可高效、选择性抑制USP2a酶活
3.2.4 GA细胞内靶向USP2a
3.3 小结与讨论
第四章:GA共价结合USP2a284 位半胱氨酸
4.1 材料与方法
4.1.1 USP2a与 GA的动力学结合常数
4.1.2 USP2a蛋白分子筛纯化
4.1.3 USP2a过 SP离子交换柱
4.1.4 USP2a质粒定点突变
4.1.5 结合口袋氨基酸位点突变
4.1.6 突变体的蛋白纯化与亲和力测试
4.1.7 USP2a晶体筛选
4.2 结果
4.2.1 GA共价结合到USP2a蛋白的Cys284 位点
4.2.2 USP2a与 GA结合的动力学特点
4.2.3 Cys284 口袋预测
4.2.4 USP2a晶体筛选优化
4.3 小结与讨论
第五章:USP2a在 MM中作用
5.1 材料与方法
5.1.1 主要试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 构建带有USP2 基因sgRNA和 Cas9 基因的表达质粒
5.1.4 单克隆挑取
5.1.5 质粒大量抽提
5.2 结果
5.2.1 USP2a在 MM中高表达且与生存期负相关
5.2.2 敲除USP2a抑制MM体外增殖
5.2.3 敲低USP2a后抑制MM体内移植瘤增殖
5.3 讨论
第六章:结语
第二部分 WP1130 靶向USP24 抑制T-ALL的机制研究
第一章 研究背景和问题的提出
1.1 T-ALL的研究进展
1.2 USP24 研究进展
1.3 本文主要研究内容概述
第二章 WP1130对T-ALL体外生物学效应研究
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 CCK-8 检测细胞增殖
2.1.4 骨髓标本单个核细胞分离
2.1.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡
2.1.6 Western blotting(蛋白印迹)
2.1.7 统计学分析
2.2 结果
2.2.1 WP1130 抑制T-ALL细胞增殖
2.2.2 WP1130 诱导T-ALL细胞凋亡
2.3 小结与讨论
第三章 USP24在T-ALL中作用研究
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 USP24与USP9X细胞敲除实验
3.1.4 荧光定量PCR
3.2 结果
3.2.1 敲低USP24 而不是USP9X可使T-ALL细胞凋亡
3.2.2 敲低USP9X可使USP24 表达上调
3.2.3 USP24在T-ALL中高表达并且与预后负相关
3.3 小结与讨论
第四章 WP1130 可在T-ALL细胞内与USP24 相互作用
4.1 材料与方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器
4.1.3 分子对接
4.1.4 细胞热力学稳定性迁移分析实验(CETSA)
4.2 结果
4.2.1 WP1130 可共价结合于USP24 活性中心
4.2.2 WP1130 可改变USP24 的热稳定性
4.3 小结与讨论
第五章 WP1130 通过USP24-Mcl-1 通路发挥作用
5.1 材料和方法
5.1.1 主要试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 细胞线粒体跨膜电位检测
5.1.4 dCas9-sgUSP24质粒构建
5.2 结果
5.2.1 WP1130 下调Mcl-1 并且引起线粒体跨膜电位损伤
5.2.2 WP1130 通过USP24-Mcl-1 通路引起细胞凋亡
5.3 小结与讨论
第六章 WP1130 抑制T-ALL体内实验
6.1 材料与方法
6.1.1 主要试剂
6.1.2 体内动物实验
6.2 结果
6.2.1 NOD-SCID小鼠一般情况
6.2.2 移植瘤生长情况
6.2.3 移植瘤免疫组化
第七章 讨论
参考文献
致谢
学术论文和科研成果目录
附录:在"Cancer Cell International”发表论文
本文编号：3952249
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