HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用
发布时间：2024-04-02 20:58
背景与目的:宫颈癌是全球妇女癌症中仅次于乳腺癌居第四位的癌症,2018年全球宫颈癌发病人数57万例,死亡人数31.1万。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus,HR-HPV)的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌的直接病因,其中HPV16型的发病率最高,占53%。HPV16 E7蛋白是HPV致癌的关键分子,HPV16 E7蛋白只选择性表达在肿瘤细胞中,随着宫颈上皮内瘤变从CIN1到CIN3进展,HPV16 E7蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高,最终HPV16 E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。细胞学检查(如TCT)联合HR-HPV DNA检测,可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3、宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。目前,人乳头瘤病毒(HPV)的临床检测方法主要是基于PCR的方法,但是PCR法只能用于检测HPV DNA和HPV分型,但不能检测HPV E6、E7致癌蛋白,所以预测HPV阳性癌症如宫颈癌的准确率不高。本研究的目的是针对那些细胞学检测为阴性而HR...
【文章页数】：172 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 文献综述 基于人乳头瘤病毒的免疫诊断和免疫疗法用于HPV诱发癌症的研究进展
1.1 引言
1.2 基于HPV的免疫诊断
1.2.1 检测肿瘤组织和细胞中的HPV蛋白抗原
1.2.2 检测患者唾液或阴道冲洗液中的抗HPV蛋白抗体
1.2.3 检测患者血清中抗HPV抗体
1.3 基于HPV的免疫治疗
1.3.1 用于治疗的天然抗HPV蛋白单克隆抗体
1.3.2 用于治疗的基于HPV蛋白mAb的放射免疫疗法
1.3.3 用于治疗的亲和毒素
1.3.4 用于治疗的HPV细胞内单链抗体(scFvs)
1.3.5 用于治疗的HPV纳米抗体
1.3.6 治疗性疫苗接种
1.4 结论和展望
第2章 引言
2.1 研究背景及目的意义
2.2 主要研究内容
2.2.1 HPV16E7蛋白的制备
2.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备
2.2.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征
2.2.4 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用
2.2.5 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在常规双抗夹心ELISA中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
2.2.6 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
2.3 技术总路线
第3章 HPV16 E7 基因的克隆、表达及HPV16 E7 蛋白的纯化
3.1 材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 方法
3.2 结果与分析
3.2.1 重组质粒p ET-28a(+)-HPV16 E7 的构建
3.2.2 HPV16E7蛋白的诱导表达
3.2.3 HPV16E7蛋白的表达形式和镍柱纯化
3.2.4 HPV16 E7 蛋白的DEAE柱纯化及其二级结构的测定
3.3 讨论
3.3.1 HPV16E7基因的克隆、鉴定
3.3.2 HPV16E7蛋白的表达和纯化
3.4 小结
第4章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备和纯化
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.2 结果与分析
4.2.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立
4.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备、收集和保存
4.2.3 二步法纯化Ig G2a亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体单抗69E2
4.2.4 二步法-辛酸-硫酸铵沉淀加Protein A的方案纯化Ig M亚型单抗69A6
4.2.5 四步法-硫酸铵沉淀+凝胶过滤层析+IgM柱+凝胶过滤层析的方案纯化Ig M亚型单抗79A11
4.2.6 间接ELISA测定纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价
4.3 讨论
4.3.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立
4.3.2 阳性克隆杂交瘤细胞株的筛选方法的建立
4.3.3 饲养层细胞的制备
4.3.4 细胞融合
4.3.5 杂交瘤细胞株的HAT选择性培养
4.3.6 阳性克隆的筛选
4.3.7 克隆化
4.3.8 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备
4.3.9 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的保存
4.3.10 Ig G2a和 Ig M亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的纯化
4.3.11 ELISA检测纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价
4.4 小结
第5章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.2 结果与分析
5.2.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对
5.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的亚型和氨基酸序列测定
5.2.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定
5.2.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位鉴定
5.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的特异性表位的保守性分析
5.3 讨论
5.3.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对
5.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的核苷酸序列的测定和氨基酸序列的预测
5.3.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定
5.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位比较
5.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2、69A6 的特异性表位的保守性分析
5.4 小结
第6章 HPV16 E7 蛋白单抗在免疫组化、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用
6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.2 方法
6.2 结果与分析
6.2.1 8株HPV16 E7 单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Western Blot反应
6.2.2 8株HPV16E7单克隆抗体在免疫细胞化学中的诊断应用
6.2.3 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用
6.2.4 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用
6.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6与Ca Ski和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应
6.3 讨论
6.3.1 8株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Weastern Blot反应
6.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫细胞化学中的诊断应用
6.3.3 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用
6.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用
6.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6在Western Blot中的诊断应用
6.4 小结
第7章 定量检测HPV16 E7 蛋白的常规双抗夹心ELISA法的建立
7.1 材料与方法
7.1.1 材料
7.1.2 方法
7.2 结果与分析
7.2.1 间接ELISA检测捕获抗体79A11 和检测抗体69E2 的效价
7.2.2 直接ELISA检测偶联物HRP-69E2 的抗体效价
7.2.3 封闭条件的优化
7.2.4 双抗夹心ELISA的棋盘实验
7.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体79A11反应时间的优化
7.2.6 抗原HPV16 E7 蛋白在ngμg级以3 倍稀释法稀释时的线性关系
7.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释时的线性关系和定量限
7.3 讨论
7.4 小结
第8章 单抗在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16E7蛋白的诊断应用
8.1 材料与方法
8.1.1 材料
8.1.2 方法
8.2 结果与分析
8.2.1 间接ELISA测定单抗79A11和69E2 的抗体效价
8.2.2 直接ELISA测定检测抗体偶联物Biotin-69E2 的抗体效价
8.2.3 化学发光免疫分析方法的原理
8.2.4 捕获抗体79A11 和检测抗体Biotin-69E2 的最适工作浓度优化
8.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体反应的时间优化
8.2.6 封闭条件的优化
8.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释
8.2.8 抗原HPV16 E7 蛋白在μg级以等比等差法稀释
8.2.9 抗原在ngμg级以3倍法稀释
8.2.10 制备参考曲线和检测临床标本
8.3 讨论
8.4 小结
第9章 全文总结
9.1 HPV16E7蛋白的制备
9.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备
9.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征
9.4 3株单抗79A11、69E2和69A6 定性检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
9.5 2株单抗79A11和69E2 定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
论文创新点
不足和展望
参考文献
博士期间发表文章及课题参研情况
致谢
本文编号：3946195
【文章页数】：172 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 文献综述 基于人乳头瘤病毒的免疫诊断和免疫疗法用于HPV诱发癌症的研究进展
1.1 引言
1.2 基于HPV的免疫诊断
1.2.1 检测肿瘤组织和细胞中的HPV蛋白抗原
1.2.2 检测患者唾液或阴道冲洗液中的抗HPV蛋白抗体
1.2.3 检测患者血清中抗HPV抗体
1.3 基于HPV的免疫治疗
1.3.1 用于治疗的天然抗HPV蛋白单克隆抗体
1.3.2 用于治疗的基于HPV蛋白mAb的放射免疫疗法
1.3.3 用于治疗的亲和毒素
1.3.4 用于治疗的HPV细胞内单链抗体(scFvs)
1.3.5 用于治疗的HPV纳米抗体
1.3.6 治疗性疫苗接种
1.4 结论和展望
第2章 引言
2.1 研究背景及目的意义
2.2 主要研究内容
2.2.1 HPV16E7蛋白的制备
2.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备
2.2.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征
2.2.4 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用
2.2.5 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在常规双抗夹心ELISA中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
2.2.6 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
2.3 技术总路线
第3章 HPV16 E7 基因的克隆、表达及HPV16 E7 蛋白的纯化
3.1 材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 方法
3.2 结果与分析
3.2.1 重组质粒p ET-28a(+)-HPV16 E7 的构建
3.2.2 HPV16E7蛋白的诱导表达
3.2.3 HPV16E7蛋白的表达形式和镍柱纯化
3.2.4 HPV16 E7 蛋白的DEAE柱纯化及其二级结构的测定
3.3 讨论
3.3.1 HPV16E7基因的克隆、鉴定
3.3.2 HPV16E7蛋白的表达和纯化
3.4 小结
第4章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备和纯化
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.2 结果与分析
4.2.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立
4.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备、收集和保存
4.2.3 二步法纯化Ig G2a亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体单抗69E2
4.2.4 二步法-辛酸-硫酸铵沉淀加Protein A的方案纯化Ig M亚型单抗69A6
4.2.5 四步法-硫酸铵沉淀+凝胶过滤层析+IgM柱+凝胶过滤层析的方案纯化Ig M亚型单抗79A11
4.2.6 间接ELISA测定纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价
4.3 讨论
4.3.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立
4.3.2 阳性克隆杂交瘤细胞株的筛选方法的建立
4.3.3 饲养层细胞的制备
4.3.4 细胞融合
4.3.5 杂交瘤细胞株的HAT选择性培养
4.3.6 阳性克隆的筛选
4.3.7 克隆化
4.3.8 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备
4.3.9 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的保存
4.3.10 Ig G2a和 Ig M亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的纯化
4.3.11 ELISA检测纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价
4.4 小结
第5章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.2 结果与分析
5.2.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对
5.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的亚型和氨基酸序列测定
5.2.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定
5.2.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位鉴定
5.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的特异性表位的保守性分析
5.3 讨论
5.3.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对
5.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的核苷酸序列的测定和氨基酸序列的预测
5.3.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定
5.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位比较
5.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2、69A6 的特异性表位的保守性分析
5.4 小结
第6章 HPV16 E7 蛋白单抗在免疫组化、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用
6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.2 方法
6.2 结果与分析
6.2.1 8株HPV16 E7 单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Western Blot反应
6.2.2 8株HPV16E7单克隆抗体在免疫细胞化学中的诊断应用
6.2.3 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用
6.2.4 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用
6.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6与Ca Ski和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应
6.3 讨论
6.3.1 8株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Weastern Blot反应
6.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫细胞化学中的诊断应用
6.3.3 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用
6.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用
6.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6在Western Blot中的诊断应用
6.4 小结
第7章 定量检测HPV16 E7 蛋白的常规双抗夹心ELISA法的建立
7.1 材料与方法
7.1.1 材料
7.1.2 方法
7.2 结果与分析
7.2.1 间接ELISA检测捕获抗体79A11 和检测抗体69E2 的效价
7.2.2 直接ELISA检测偶联物HRP-69E2 的抗体效价
7.2.3 封闭条件的优化
7.2.4 双抗夹心ELISA的棋盘实验
7.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体79A11反应时间的优化
7.2.6 抗原HPV16 E7 蛋白在ngμg级以3 倍稀释法稀释时的线性关系
7.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释时的线性关系和定量限
7.3 讨论
7.4 小结
第8章 单抗在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16E7蛋白的诊断应用
8.1 材料与方法
8.1.1 材料
8.1.2 方法
8.2 结果与分析
8.2.1 间接ELISA测定单抗79A11和69E2 的抗体效价
8.2.2 直接ELISA测定检测抗体偶联物Biotin-69E2 的抗体效价
8.2.3 化学发光免疫分析方法的原理
8.2.4 捕获抗体79A11 和检测抗体Biotin-69E2 的最适工作浓度优化
8.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体反应的时间优化
8.2.6 封闭条件的优化
8.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释
8.2.8 抗原HPV16 E7 蛋白在μg级以等比等差法稀释
8.2.9 抗原在ngμg级以3倍法稀释
8.2.10 制备参考曲线和检测临床标本
8.3 讨论
8.4 小结
第9章 全文总结
9.1 HPV16E7蛋白的制备
9.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备
9.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征
9.4 3株单抗79A11、69E2和69A6 定性检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
9.5 2株单抗79A11和69E2 定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用
论文创新点
不足和展望
参考文献
博士期间发表文章及课题参研情况
致谢
本文编号：3946195
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