以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究
发布时间：2024-03-24 20:15
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病,是当代社会中老年人口中最常见的痴呆形式。AD的神经病理学特征包括由淀粉样蛋白(Aβ)形成的细胞外斑块、过度磷酸化微管相关蛋白(tau)积累形成的细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和广泛的神经元丢失。长久以来,“淀粉样蛋白级联假说”认为Aβ肽的异常积累是AD发病的关键。然而,迄今为止,集中于减少Aβ沉积的Aβ免疫疗法均未产生临床上有意义的结果。因此,单纯通过消除Aβ病理学不足以达到治愈AD的效果,而开发靶向tau病理学的治疗手段也成为了一种非常有潜力的治疗策略之一。Tau蛋白是哺乳动物神经系统中的一种主要的微管相关蛋白(由microtubule-associated protein(MAPT)基因编码),在生理条件下调节微管的组装和稳定性以及轴突运输。然而,在病理生理条件下,在AD和相关的病理性疾病(包括皮质基底变性(CBD),进行性核上麻痹(PSP),Pick病(PD)和额颞叶痴呆(FTLD))中,大量毒性表位的tau出现了异常高水平的磷酸化,如Ser...
【文章页数】：235 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
关键词及缩写
第一章 前言
1.1 阿尔茨海默病
1.1.1 阿尔茨海默病研究发展进程
1.1.2 阿尔茨海默病的流行病学
1.1.3 阿尔茨海默病发病机制研究
1.1.3.1 Aβ 蛋白级联假说
1.1.3.2 Tau蛋白致病假说
1.2 阿尔茨海默病动物模型研究
1.2.1 转基因啮齿类动物模型
1.2.1.1 Aβ 病理转基因鼠
1.2.1.2 Tau病理转基因鼠
1.2.2 非人灵长类动物模型
1.3 阿尔茨海默病治疗现状
1.3.1 阿尔茨海默病治疗策略及分类
1.3.2 以tau为靶点的阿尔茨海默病疗法
1.3.2.1 主动免疫疗法
1.3.2.2 被动免疫疗法
1.3.2.3 微管稳定剂类
1.3.2.4 Tau聚集抑制剂类
1.3.2.5 调节tau磷酸化水平
1.4 靶向tau的免疫治疗方法的机制
1.5 诺如病毒P颗粒疫苗载体系统
1.5.1 诺如病毒
1.5.2 诺如病毒P颗粒
1.5.3 基于诺如病毒P颗粒蛋白载体的疫苗研究现状
1.6 研究意义与实验设计
1.6.1 研究意义
1.6.2 实验思路与设计
1.6.2.1 P301S模型小鼠跟踪部分
1.6.2.2 AD疫苗部分
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌种、质粒载体与细胞
2.1.3 多肽合成
2.1.4 实验设备
2.1.5 实验试剂与耗材
2.1.6 溶液配制
2.1.6.1 鼠尾消化液
2.1.6.2 TAE缓冲液
2.1.6.3 PBS
2.1.6.4 变性电泳缓冲液(SDS-running buffer)
2.1.6.5 非变性电泳缓冲液(native running buffer)
2.1.6.6 电转缓冲液
2.1.6.7 考马斯亮蓝染色液
2.1.6.8 脱色液
2.1.6.9 Basal buffer
2.1.6.10 10×DNA loading buffer
2.1.6.11 5×蛋白loading buffer
2.1.6.12 5×蛋白native loading buffer
2.1.6.13 戊巴比妥钠溶液
2.1.6.14 4%多聚甲醛溶液
2.1.6.15 分化液
2.1.6.16 返蓝液
2.1.6.17 柠檬酸抗原修复液
2.1.6.18 TBS与TBST
2.1.6.19 PMSF母液
2.1.6.20 Na F母液
2.1.6.21 钒酸钠母液
2.1.6.22 焦磷酸钠(Na2P2O4)母液
2.1.6.23 RAB buffer
2.1.6.24 RIPA buffer
2.1.6.25 Urea buffer(脑匀浆用)
2.1.6.26 30%丙烯酰胺溶液
2.1.6.27 氨苄青霉素溶液
2.1.6.28 卡那霉素溶液
2.1.6.29 氯霉素溶液
2.1.6.30 L-阿拉伯糖溶液
2.1.6.31 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)
2.1.6.32 (亲和层析)平衡液
2.1.6.33 (亲和层析)咪唑洗脱液
2.1.6.34 抗原包被液
2.1.6.35 连接反应用碳酸氢铵溶液
2.1.6.36 R10培养基
2.1.6.37 ACK(红细胞裂解液)
2.1.6.38 (293T)细胞复苏液
2.1.6.39 (293T)细胞培养基
2.1.6.40 胰酶
2.2 实验方法
2.2.1 动物饲养及动物伦理
2.2.2 P301S转基因小鼠基因型鉴定
2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
2.2.4 小鼠行为学实验
2.2.4.1 握力实验
2.2.4.2 加速转棒实验
2.2.4.3 步幅长度
2.2.4.4 复合表型评分系统(肢体协调综合评分)
2.2.4.5 筑巢实验
2.2.4.6 旷场实验
2.2.4.7 水迷宫实验
2.2.5 动物血浆及组织样本取材与保存
2.2.5.1 血浆样本取材与保存
2.2.5.2 血清样本取材与保存
2.2.5.3 组织样本取材与保存
2.2.6 组织切片与染色
2.2.6.1 石蜡切片的制备
2.2.6.2 HE染色
2.2.6.3 甲苯胺蓝染色
2.2.6.4 免疫组织化学染色(IHC)
2.2.7 脑匀浆制备
2.2.8 蛋白电泳
2.2.8.1 SDS-PAGE(变性)电泳
2.2.8.2 Native PAGE(非变性)电泳
2.2.9 考马斯亮蓝染色
2.2.10 免疫印迹实验
2.2.10.1 Western blot
2.2.10.2 Dot blot
2.2.11 质粒构建
2.2.11.1 pCold Ⅳ-PP-3C质粒构建
2.2.11.2 pET20b-Tau质粒构建
2.2.11.3 pCDNA3.1-YFP /pCDNA3.1-CFP质粒构建
2.2.11.4 pCDNA3.1-RD(WT)-(HA)质粒构建
2.2.11.5 pCDNA3.1-LM-(HA)/pCDNA3.1-△K-(HA)质粒构建
2.2.11.6 pCDNA3.1-△K-YFP /pCDNA3.1-△K-CFP质粒构建
2.2.12 蛋白原核表达与纯化
2.2.12.1 PP-3C蛋白纯化
2.2.12.2 Tau蛋白的纯化
2.2.13 疫苗制备
2.2.13.1 多肽疫苗的制备
2.2.13.2 PP-pTau31疫苗的制备
2.2.13.3 佐剂使用
2.2.14 ELISA
2.2.14.1 血浆/脑匀浆tau含量测定
2.2.14.2 血清抗体含量测定
2.2.14.3 血清抗体分型实验
2.2.15 硫酸铵沉淀法纯化血清蛋白
2.2.16 ELISPOT
2.2.17 细胞培养
2.2.18 质粒转染
2.2.19 FRET实验
2.2.20 统计学方法
第三章 实验结果与讨论:P301S转基因小鼠行为学、病理学及血清学跟踪研究
3.1 行为学研究
3.1.1 体重
3.1.2 生存期
3.1.3 握力实验
3.1.4 加速转棒实验
3.1.5 步幅长度
3.1.6 复合表型评分系统(肢体协调综合评分)
3.1.7 水迷宫实验
3.1.8 旷场实验
3.1.9 筑巢实验
3.1.10 小结
3.2 病理学研究
3.2.1 免疫印迹实验(western blot)
3.2.2 免疫组织化学染色(IHC)
3.2.3 脏器变化
3.2.4 小结
3.3 血清学研究
3.3.1 血浆中人源tau蛋白变化
3.3.2 血浆炎症因子和趋化因子变化
3.3.3 脑匀浆炎症因子和趋化因子变化
3.3.4 小结
3.4 检测因子相关性分析
3.5 讨论
3.6 结论
第四章 实验结果与讨论:以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗对AD治疗效果和作用机制研究
4.1 磷酸化tau表位疫苗磷酸化表位筛选
4.1.1 候选重组磷酸化tau多肽的设计
4.1.2 候选重组磷酸化tau多肽的免疫原性分析
4.1.3 优选重组磷酸化tau多肽表位pTau31的安全性分析
4.1.4 小结
4.2 以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗的制备与表征
4.2.1 PP-pTau31表位疫苗的设计
4.2.2 诺如病毒P颗粒蛋白基因突变与构建
4.2.3 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C的表达与纯化
4.2.4 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C理化性质分析
4.2.4.1 PP-3C蛋白分子量及聚体形式分析
4.2.4.2 透射电镜(TEM)对重组诺如病毒P蛋白形态分析
4.2.5 重组诺如病毒P颗粒蛋白与pTau31多肽连接工艺与连接效率研究
4.2.6 小结
4.3 磷酸化tau表位疫苗PP-pTau31的免疫原性与优选佐剂研究
4.3.1 PP-pTau31的免疫原性评价
4.3.1.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计
4.3.1.2 PP-pTau31免疫原性评价
4.3.2 优选疫苗佐剂筛选
4.3.2.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计
4.3.2.2 免疫原性评价
4.3.3 PP-pTau31疫苗诱导的T细胞免疫反应分析
4.3.4 小结
4.4 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫效果研究
4.4.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫方案设计
4.4.2 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫原性分析
4.4.3 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后的行为学变化研究
4.4.3.1 P301S转基因鼠体重变化
4.4.3.2 P301S转基因鼠生存期变化
4.4.3.3 P301S转基因鼠运动相关行为学变化
4.4.3.4 P301S转基因鼠认知行为学变化
4.4.4 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后脑中蛋白水平变化研究
4.4.4.1 P301S转基因鼠脑匀浆中tau蛋白水平变化
4.4.4.2 P301S转基因鼠脑海马区tau蛋白水平变化
4.4.4.3 P301S转基因鼠脑海马区胶质细胞水平变化
4.4.5 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中治疗的安全性分析
4.4.5.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中诱导的T细胞免疫反应分析
4.4.5.2 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠血清中细胞因子的变化
4.4.5.3 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的脑匀浆细胞因子变化
4.4.5.4 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的组织病理变化
4.4.6 小结
4.5 PP-pTau31疫苗的免疫作用机制研究
4.5.1 免疫治疗后P301S转基因鼠血浆tau蛋白水平变化
4.5.2 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性分析
4.5.2.1 FRET检测游离tau蛋白活性方法建立
4.5.2.1.1 质粒构建
4.5.2.1.2 质粒表达验证
4.5.2.1.3 FRET检测方法适用性评估
4.5.2.3 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性检测
4.5.3 PP-pTau31疫苗诱导的抗体性质分析
4.5.3.1 血清抗体结合NFT效果研究
4.5.3.2 血清抗体对脑匀浆中tau蛋白传播活性的抑制效果研究
4.5.4 小结
4.6 讨论
4.7 结论
展望
参考文献
作者简历及攻读博士学位期间科研成果
致谢
本文编号：3937952
【文章页数】：235 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
关键词及缩写
第一章 前言
1.1 阿尔茨海默病
1.1.1 阿尔茨海默病研究发展进程
1.1.2 阿尔茨海默病的流行病学
1.1.3 阿尔茨海默病发病机制研究
1.1.3.1 Aβ 蛋白级联假说
1.1.3.2 Tau蛋白致病假说
1.2 阿尔茨海默病动物模型研究
1.2.1 转基因啮齿类动物模型
1.2.1.1 Aβ 病理转基因鼠
1.2.1.2 Tau病理转基因鼠
1.2.2 非人灵长类动物模型
1.3 阿尔茨海默病治疗现状
1.3.1 阿尔茨海默病治疗策略及分类
1.3.2 以tau为靶点的阿尔茨海默病疗法
1.3.2.1 主动免疫疗法
1.3.2.2 被动免疫疗法
1.3.2.3 微管稳定剂类
1.3.2.4 Tau聚集抑制剂类
1.3.2.5 调节tau磷酸化水平
1.4 靶向tau的免疫治疗方法的机制
1.5 诺如病毒P颗粒疫苗载体系统
1.5.1 诺如病毒
1.5.2 诺如病毒P颗粒
1.5.3 基于诺如病毒P颗粒蛋白载体的疫苗研究现状
1.6 研究意义与实验设计
1.6.1 研究意义
1.6.2 实验思路与设计
1.6.2.1 P301S模型小鼠跟踪部分
1.6.2.2 AD疫苗部分
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌种、质粒载体与细胞
2.1.3 多肽合成
2.1.4 实验设备
2.1.5 实验试剂与耗材
2.1.6 溶液配制
2.1.6.1 鼠尾消化液
2.1.6.2 TAE缓冲液
2.1.6.3 PBS
2.1.6.4 变性电泳缓冲液(SDS-running buffer)
2.1.6.5 非变性电泳缓冲液(native running buffer)
2.1.6.6 电转缓冲液
2.1.6.7 考马斯亮蓝染色液
2.1.6.8 脱色液
2.1.6.9 Basal buffer
2.1.6.10 10×DNA loading buffer
2.1.6.11 5×蛋白loading buffer
2.1.6.12 5×蛋白native loading buffer
2.1.6.13 戊巴比妥钠溶液
2.1.6.14 4%多聚甲醛溶液
2.1.6.15 分化液
2.1.6.16 返蓝液
2.1.6.17 柠檬酸抗原修复液
2.1.6.18 TBS与TBST
2.1.6.19 PMSF母液
2.1.6.20 Na F母液
2.1.6.21 钒酸钠母液
2.1.6.22 焦磷酸钠(Na2P2O4)母液
2.1.6.23 RAB buffer
2.1.6.24 RIPA buffer
2.1.6.25 Urea buffer(脑匀浆用)
2.1.6.26 30%丙烯酰胺溶液
2.1.6.27 氨苄青霉素溶液
2.1.6.28 卡那霉素溶液
2.1.6.29 氯霉素溶液
2.1.6.30 L-阿拉伯糖溶液
2.1.6.31 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)
2.1.6.32 (亲和层析)平衡液
2.1.6.33 (亲和层析)咪唑洗脱液
2.1.6.34 抗原包被液
2.1.6.35 连接反应用碳酸氢铵溶液
2.1.6.36 R10培养基
2.1.6.37 ACK(红细胞裂解液)
2.1.6.38 (293T)细胞复苏液
2.1.6.39 (293T)细胞培养基
2.1.6.40 胰酶
2.2 实验方法
2.2.1 动物饲养及动物伦理
2.2.2 P301S转基因小鼠基因型鉴定
2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
2.2.4 小鼠行为学实验
2.2.4.1 握力实验
2.2.4.2 加速转棒实验
2.2.4.3 步幅长度
2.2.4.4 复合表型评分系统(肢体协调综合评分)
2.2.4.5 筑巢实验
2.2.4.6 旷场实验
2.2.4.7 水迷宫实验
2.2.5 动物血浆及组织样本取材与保存
2.2.5.1 血浆样本取材与保存
2.2.5.2 血清样本取材与保存
2.2.5.3 组织样本取材与保存
2.2.6 组织切片与染色
2.2.6.1 石蜡切片的制备
2.2.6.2 HE染色
2.2.6.3 甲苯胺蓝染色
2.2.6.4 免疫组织化学染色(IHC)
2.2.7 脑匀浆制备
2.2.8 蛋白电泳
2.2.8.1 SDS-PAGE(变性)电泳
2.2.8.2 Native PAGE(非变性)电泳
2.2.9 考马斯亮蓝染色
2.2.10 免疫印迹实验
2.2.10.1 Western blot
2.2.10.2 Dot blot
2.2.11 质粒构建
2.2.11.1 pCold Ⅳ-PP-3C质粒构建
2.2.11.2 pET20b-Tau质粒构建
2.2.11.3 pCDNA3.1-YFP /pCDNA3.1-CFP质粒构建
2.2.11.4 pCDNA3.1-RD(WT)-(HA)质粒构建
2.2.11.5 pCDNA3.1-LM-(HA)/pCDNA3.1-△K-(HA)质粒构建
2.2.11.6 pCDNA3.1-△K-YFP /pCDNA3.1-△K-CFP质粒构建
2.2.12 蛋白原核表达与纯化
2.2.12.1 PP-3C蛋白纯化
2.2.12.2 Tau蛋白的纯化
2.2.13 疫苗制备
2.2.13.1 多肽疫苗的制备
2.2.13.2 PP-pTau31疫苗的制备
2.2.13.3 佐剂使用
2.2.14 ELISA
2.2.14.1 血浆/脑匀浆tau含量测定
2.2.14.2 血清抗体含量测定
2.2.14.3 血清抗体分型实验
2.2.15 硫酸铵沉淀法纯化血清蛋白
2.2.16 ELISPOT
2.2.17 细胞培养
2.2.18 质粒转染
2.2.19 FRET实验
2.2.20 统计学方法
第三章 实验结果与讨论:P301S转基因小鼠行为学、病理学及血清学跟踪研究
3.1 行为学研究
3.1.1 体重
3.1.2 生存期
3.1.3 握力实验
3.1.4 加速转棒实验
3.1.5 步幅长度
3.1.6 复合表型评分系统(肢体协调综合评分)
3.1.7 水迷宫实验
3.1.8 旷场实验
3.1.9 筑巢实验
3.1.10 小结
3.2 病理学研究
3.2.1 免疫印迹实验(western blot)
3.2.2 免疫组织化学染色(IHC)
3.2.3 脏器变化
3.2.4 小结
3.3 血清学研究
3.3.1 血浆中人源tau蛋白变化
3.3.2 血浆炎症因子和趋化因子变化
3.3.3 脑匀浆炎症因子和趋化因子变化
3.3.4 小结
3.4 检测因子相关性分析
3.5 讨论
3.6 结论
第四章 实验结果与讨论:以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗对AD治疗效果和作用机制研究
4.1 磷酸化tau表位疫苗磷酸化表位筛选
4.1.1 候选重组磷酸化tau多肽的设计
4.1.2 候选重组磷酸化tau多肽的免疫原性分析
4.1.3 优选重组磷酸化tau多肽表位pTau31的安全性分析
4.1.4 小结
4.2 以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗的制备与表征
4.2.1 PP-pTau31表位疫苗的设计
4.2.2 诺如病毒P颗粒蛋白基因突变与构建
4.2.3 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C的表达与纯化
4.2.4 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C理化性质分析
4.2.4.1 PP-3C蛋白分子量及聚体形式分析
4.2.4.2 透射电镜(TEM)对重组诺如病毒P蛋白形态分析
4.2.5 重组诺如病毒P颗粒蛋白与pTau31多肽连接工艺与连接效率研究
4.2.6 小结
4.3 磷酸化tau表位疫苗PP-pTau31的免疫原性与优选佐剂研究
4.3.1 PP-pTau31的免疫原性评价
4.3.1.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计
4.3.1.2 PP-pTau31免疫原性评价
4.3.2 优选疫苗佐剂筛选
4.3.2.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计
4.3.2.2 免疫原性评价
4.3.3 PP-pTau31疫苗诱导的T细胞免疫反应分析
4.3.4 小结
4.4 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫效果研究
4.4.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫方案设计
4.4.2 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫原性分析
4.4.3 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后的行为学变化研究
4.4.3.1 P301S转基因鼠体重变化
4.4.3.2 P301S转基因鼠生存期变化
4.4.3.3 P301S转基因鼠运动相关行为学变化
4.4.3.4 P301S转基因鼠认知行为学变化
4.4.4 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后脑中蛋白水平变化研究
4.4.4.1 P301S转基因鼠脑匀浆中tau蛋白水平变化
4.4.4.2 P301S转基因鼠脑海马区tau蛋白水平变化
4.4.4.3 P301S转基因鼠脑海马区胶质细胞水平变化
4.4.5 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中治疗的安全性分析
4.4.5.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中诱导的T细胞免疫反应分析
4.4.5.2 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠血清中细胞因子的变化
4.4.5.3 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的脑匀浆细胞因子变化
4.4.5.4 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的组织病理变化
4.4.6 小结
4.5 PP-pTau31疫苗的免疫作用机制研究
4.5.1 免疫治疗后P301S转基因鼠血浆tau蛋白水平变化
4.5.2 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性分析
4.5.2.1 FRET检测游离tau蛋白活性方法建立
4.5.2.1.1 质粒构建
4.5.2.1.2 质粒表达验证
4.5.2.1.3 FRET检测方法适用性评估
4.5.2.3 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性检测
4.5.3 PP-pTau31疫苗诱导的抗体性质分析
4.5.3.1 血清抗体结合NFT效果研究
4.5.3.2 血清抗体对脑匀浆中tau蛋白传播活性的抑制效果研究
4.5.4 小结
4.6 讨论
4.7 结论
展望
参考文献
作者简历及攻读博士学位期间科研成果
致谢
本文编号：3937952
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3937952.html
教材专著