药物动员骨髓干细胞促进重症糖尿病大鼠创面愈合及其作用机制的研究

发布时间：2023-11-08 18:40

　　研究目的当前,糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcer,DFU)的治疗方案单一,以局部清创、药物涂抹为主,疗效欠佳。基于创面愈合的研究很多,但是尚无通过系统给药显著性促进创面愈合的药物。为了探究普乐沙福/释倍灵(AMD3100,Plerixafor,Mozobil)联合低剂量他克莫司/普乐可复(FK506,Tacrolimus,Prograf)治疗方案(简写AF治疗方案)是否可以促进糖尿病大鼠皮肤伤口愈合,以及愈合过程中AF治疗方案是如何发挥促进愈合的作用及其潜在的分子机制,本项目从验证药物有效性着手,通过寻找相关分子通路,希望为临床应用自体骨髓干细胞医治DFU提供一个可行的方案。研究方法本实验利用链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM)大鼠模型;同时使用Goto-Kakizaki(GK)大鼠复制2型非肥胖自发糖尿病模型。在确定其已合并周围神经和外周血管病变的重症糖尿病并发症后给予AF药物治疗,分别测试药物在这两种模型中对糖尿病创面愈合的修复作用。利用新合成的FK506类似物FKVP来探究BMP通路在AF治疗方案中影响...

【文章页数】：144 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
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第1章 引言
第2章 文献综述
    2.1 糖尿病及糖尿病足的流行病学
    2.2 正常皮肤的结构
    2.3 伤口愈合的生物学过程及基本理论
    2.4 针对糖尿病皮肤伤口的临床治疗及科研现状
        2.4.1 清创术
        2.4.2 预防细菌感染
        2.4.3 负压引流
        2.4.4 输血疗法-血小板富集血浆
        2.4.5 高压氧
        2.4.6 物理治疗
            2.4.6.1 光疗
            2.4.6.2 冲击波治疗
            2.4.6.3 超声治疗
            2.4.6.4 电刺激敷料
        2.4.7 生长因子与细胞因子
        2.4.8 组织移植、皮肤移植与皮瓣移植
    2.5 干细胞在糖尿病皮肤伤口愈合中的治疗及研究进展
    2.6 AMD3100或FK506 对促进组织修复和再生的研究进展
第3章 AMD3100+低剂量FK506 促进糖尿病大鼠伤口愈合的有效性研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要实验仪器
        3.1.2 主要实验材料、试剂和抗体
        3.1.3 实验动物
        3.1.4 1型糖尿病大鼠模型的建立
        3.1.5 2型糖尿病大鼠模型的建立
        3.1.6 大鼠背部伤口模型
        3.1.7 大鼠足背部伤口模型(糖尿病足模型)
        3.1.8 照片拍摄、伤口及瘢痕大小的测量方法及愈合标准的判定
        3.1.9 病理切片普通及特殊染色
            3.1.9.1 苏木素&伊红(H& E)染色
            3.1.9.2 Masson’s trichrome染色
            3.1.9.3 过碘酸雪夫(PAS)染色
        3.1.10 免疫组织化学染色及免疫荧光染色
            3.1.10.1 抗CD133 抗体染色
            3.1.10.2 抗CD34 抗体染色
            3.1.10.3 抗Ym1/Ym2 抗体染色
            3.1.10.4 抗RECA-1 抗体染色
            3.1.10.5 抗αSMA抗体染色
            3.1.10.6 抗PGP9.5 抗体染色
            3.1.10.7 抗CD68(ED1)和Ym1/Ym2 荧光共染
            3.1.10.8 抗SDF-1α和 Ym1/Ym2 荧光共染
            3.1.10.9 GFP+早期肉芽组织标本CD133 抗体染色
        3.1.11 Western Blot蛋白印迹
        3.1.12 大鼠断尾采血、骨髓细胞分离、外周血单个核细胞分离及流式细胞术
        3.1.13 骨髓移植术
        3.1.14 大鼠下肢(足)皮肤温度的测量
        3.1.15 大鼠热板实验
        3.1.16 数据统计分析
    3.2 实验结果
        3.2.1 在T1DMSD大鼠模型中,切除全层皮肤,皮肤愈合时间显著延长,AF使治疗组愈合时间缩短,基本等同于非糖尿病大鼠自然愈合的时间。
        3.2.2 AF治疗方案可以缩短患有严重外周神经和血管病变的GK T2DM大鼠伤口愈合的时间
        3.2.3 AF方案可以动员单核细胞和标记CD34、CD133 的干细胞入血,增加肉芽组织中Ym1/Ym2M2 巨噬细胞、CD133、CD34干细胞表达SDF-1α
        3.2.4 伤口处募集干细胞,VEGF-A和 HGFα表达增强,促进了新生血管的生成
        3.2.5 骨髓移植模型证实了在应用AF治疗方案后,骨髓来源的干细胞促进糖尿病伤口愈合的重要作用
        3.2.6 AF治疗方案改善了大鼠后肢糖尿病血管病变,提高了足部皮肤温度
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
第4章 BMP信号通路的激活促进伤口愈合的实验研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验动物及饲养环境
        4.1.2 伤口模型及分组情况
        4.1.3 免疫组化染色
        4.1.4 细胞培养与转染
        4.1.5 细胞活力测定
        4.1.6 Western Blot蛋白印迹
        4.1.7 FKBP12-SNAP的下拉(Pull-Downs)
        4.1.8 敲除FKBP的细胞系
        4.1.9 BMP和 NFAT途径报告基因
        4.1.10 FKVP的合成和用于动物实验的配方
        4.1.11 数据统计分析
    4.2 实验结果
        4.2.1 合成了没有免疫抑制作用的FK506 类似物FKVP
        4.2.2 FKVP联合AMD3100 可以促进伤口愈合,且结果同AF治疗方案一样好
        4.2.3 FKVP通过BMP-1 型受体激活ID-1 报告基因且使SMAD1/5 磷酸化
        4.2.4 FKVP诱导的SMAD1/5 磷酸化仅需要FKBP
        4.2.5 AF联合治疗在加速伤口愈合中的作用需要BMP信号传导
    4.3 讨论
    4.4 本章小结
第5章 结论
第6章 创新点
参考文献
作者在学期间所取得的科研成果
致谢



本文编号：3861527