基于反向旋转挤出技术构建的取向性胶原纤维及其在肌腱修复中的应用

发布时间：2023-06-17 21:07

　　因疾病、交通事故或不当的体育运动造成的肌腱损伤是常见的临床问题。肌腱组织因具有少细胞、寡供血以及低代谢的结构特征,使受损肌腱,包括受损腱体和肌腱止点损伤的腱-骨区域,难以自愈。将干细胞与仿生支架复合的组织工程策略为有效修复损伤肌腱带来了希望。从全面仿生天然肌腱胞外基质(ECM)的组成、拓扑结构和力学性质的策略出发,我们认为,高取向性胶原纤维支架是肌腱腱体修复的理想支架,而分级取向的胶原纤维支架是腱-骨连接处修复的理想支架。由于难溶性胶原纤维(ICFs)拥有更多天然分子交联和分子排列,其自组装程度和力学性能更接近天然肌腱ECM,因此,我们进一步认为,ICFs比可溶性胶原更适合于肌腱修复支架的加工。但遗憾的是,目前以ICFs为原料的取向性纤维的加工技术较为缺乏。反向旋转挤出(CRE)技术适用于ICFs支架的加工,具有纤维取向性可调、加工速度快、可控性好等优点,但迄今为止却鲜有将其应用于肌腱修复支架的加工。据此,本文在探索了ICFs的提取条件和理化性能的基础上,以ICFs为原料,创新性地采用CRE技术制备出了不同取向的胶原纤维支架,并从理化性能、体外生物学性能和体内修复效果等方面系统地评估了...

【文章页数】：158 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
主要缩略词
1 绪论
    1.1 问题的提出及研究意义
    1.2 肌腱的生物学和生理学特性
        1.2.1 细胞组成
        1.2.2 细胞外基质
        1.2.3 肌腱愈合机制
    1.3 肌腱组织工程中支架仿生策略的研究进展
        1.3.1 支架的拓扑结构对干细胞向肌腱和骨系分化行为的影响
        1.3.2 支架的表面化学对干细胞向肌腱和骨系分化行为的影响
        1.3.3 取向性胶原纤维支架在肌腱修复中的应用
    1.4 研究思路及主要研究内容
        1.4.1 研究思路
        1.4.2 主要研究内容
    1.5 本论文的创新点
2 取向性胶原纤维薄膜的制备及表征
    2.1 前言
    2.2 主要仪器设备、耗材及试剂
        2.2.1 仪器设备
        2.2.2 试剂及耗材
        2.2.3 相关试液的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 牛皮的前处理
        2.3.2 难溶性胶原纤维(ICFs)的提取
        2.3.3 酶溶性胶原(PSC)的提取
        2.3.4 胶原的结构和组成分析
        2.3.5 相关性能的比较
        2.3.6 取向性胶原纤维薄膜(CMs)的制备
        2.3.7 CMs表面拓扑结构观察
        2.3.8 CMs纤维取向的验证
        2.3.9 CMs力学拉伸性能测定
        2.3.10 伯氨基含量的测定
        2.3.11 统计分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 前处理后牛皮和粗提胶原纤维的理化性质分析
        2.4.2 ICFs提取条件的优化
        2.4.3 PSC和 ICFs的组成分析
        2.4.4 PSC和 ICFs的结构分析
        2.4.5 PSC与 ICFs相关性能的比较
        2.4.6 CMs的纤维取向和表面拓扑结构
        2.4.7 CMs纤维取向的验证分析
        2.4.8 CMs力学拉伸性能分析
        2.4.9 CMs的化学性质分析
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
3 取向性CMs对 rBMSCs早期行为及后期分化的影响
    3.1 前言
    3.2 主要仪器设备、耗材及试剂
        3.2.1 仪器设备
        3.2.2 试剂及耗材
        3.2.3 相关试剂的配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 rBMSCs的分离(全骨髓贴壁法)和培养
        3.3.2 rBMSCs的冻存和复苏
        3.3.3 rBMSCs表面标志物流式细胞术检测
        3.3.4 rBMSCs三系分化潜能检测
        3.3.5 取向性CMs的细胞相容性评价
        3.3.6 取向性CMs对 rBMSCs早期形态的影响
        3.3.7 取向性CMs对 rBMSCs分化的影响
    3.4 实验结果
        3.4.1 rBMSCs的鉴定
        3.4.2 取向性CMs的细胞相容性评价
        3.4.3 取向性CMs对 rBMSCs早期形态的影响
        3.4.4 在生长培养基中CMs纤维取向对rBMSCs分化的影响
        3.4.5 在成骨诱导培养基中CMs纤维取向对rBMSCs分化的影响
        3.4.6 在软骨诱导培养基中CMs纤维取向对rBMSCs分化的影响
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
4 高取向性CM_a-BMSCs支架对损伤腱体的原位修复
    4.1 前言
    4.2 主要仪器设备、耗材及试剂
        4.2.1 仪器设备
        4.2.2 试剂及耗材
        4.2.3 相关试液的配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 组织工程肌腱的构建
        4.3.2 裸鼠异位模型
        4.3.3大鼠跟腱缺损模型的构建及体内植入实验
        4.3.4 直观形态评分系统及其评测
        4.3.5 功能指数(AFI)测定
        4.3.6 核磁共振成像(MRI)
        4.3.7 组织学分析
        4.3.8 组织的基因和蛋白分析
        4.3.9 力学拉伸测试
    4.4 实验结果
        4.4.1 裸鼠异位模型
        4.4.2 CM-BMSCs组织工程肌腱力学拉伸性能测试
        4.4.3 再生腱体的直观形态评价
        4.4.4 再生腱体的功能性评价
        4.4.5 再生腱体的核磁共振成像
        4.4.6 肌腱相关的基因和蛋白的表达
        4.4.7 再生腱体的组织学评价
        4.4.8 再生腱体的异位骨化评价
        4.4.9 植入物的体内安全性评价
        4.4.10 再生腱体的力学拉伸性能
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
5 分级取向CM_ar-BMSCs支架对腱-骨连接处原位修复的初探
    5.1 前言
    5.2 主要仪器设备、耗材及试剂
        5.2.1 仪器设备
        5.2.2 耗材及试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 分级复合支架的制备及力学拉伸测试
        5.3.2 免疫荧光和化学法染色
        5.3.3大鼠跟腱-跟骨连接处模型的构建及体内植入实验
        5.3.4 X光成像
        5.3.5 Micro-CT成像
        5.3.6 组织学分析
        5.3.7 力学拉伸测试
    5.4 实验结果
        5.4.1 分级取向支架(CM_ar)的力学拉伸性能稳定性
        5.4.2 分级取向支架(CM_ar)对rBMSCs早期形态和分化的影响
        5.4.3 跟腱-跟骨的直观形态
        5.4.4 跟腱-跟骨的影像学成像分析
        5.4.5 跟腱-跟骨的组织学评价
        5.4.6 跟腱-跟骨的力学拉伸性能
    5.5 讨论
    5.6 本章小结
6 主要结论与后续建议
    6.1 主要结论
    6.2 后续工作建议
参考文献
附录
    A.作者在攻读学位期间发表的论文目录
    B.作者在攻读学位期间取得的科研成果目录
    C.作者在攻读学位期间参加的科研项目
    D.学位论文数据集
致谢



本文编号：3834139