肿瘤发生发展与胎盘绒毛发育相关生物学行为的研究

发布时间：2023-04-22 11:09

　　该博士学位论文由相互联系的三部分内容组成。第一部分:绒毛特异性基因蕴藏了人类多种癌症的预后分子标志物背景:肿瘤的发生发展与胎盘的发育有很多相似的生物学行为,但两者之间的关系尚未得到很好的探索。绒毛是胎盘发育的一个关键时期,涉及许多生物学过程,如滋养层细胞活跃的分裂增殖能力,逃避母体的免疫排斥,植入到子宫蜕膜及肌层等。而肿瘤细胞可能劫持了滋养层细胞的特性,两者有很多相似的生物学行为。目的:通过比较正常妊娠人工流产术后绒毛组织和成熟胎盘叶状绒毛膜组织的变化,探讨肿瘤的相应特征,为肿瘤研究提供新的途径,寻找新的癌症诊断和治疗靶点。方法:收集36例正常妊娠人工流产术后的绒毛组织和8例成熟胎盘的叶状绒毛膜组织,进行了全基因组表达谱芯片检测。结合The Cancer Genome Atlas(TCGA,癌症基因组图谱)泛癌的转录组数据,利用生物信息学的方法鉴定出早期绒毛特异性表达基因,并通过GO以及KEGG富集分析,观察其主要参与的生物学功能和通路,最后确定这些特异性基因在泛癌中的改变并且评估与患者预后的关系。结果:首先,通过与成熟胎盘叶状绒毛膜组织相比,我们鉴定出237个在早期绒毛组织中特异性表...

【文章页数】：154 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中英文缩略词
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 绒毛特异性基因蕴藏了人类多种癌症的预后分子标志物
    前言
    材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 胎盘绒毛和成熟胎盘叶状绒毛膜组织的样本收集
            1.2 获取TCGA公共数据
            1.3 主要的试剂与试剂盒
            1.4 主要仪器与耗材
            1.5 生物信息学分析软件及网站
        2. 实验方法
            2.1 总RNA的提取及纯化
            2.2 总RNA的浓度测定和质控
            2.3 AgilentmRNA表达谱芯片实验
                2.3.1 待标记样本的制备
                2.3.2 合成cDNA
                2.3.3 cRNA的合成扩增及Cy3荧光标记
                2.3.4 cRNA的纯化及质控
                2.3.5 杂交样本的准备及杂交
                2.3.6 芯片的清洗
                2.3.7 芯片的扫描和数据提取及质控
            2.4 数据分析
                2.4.1 数据预处理和标准化
                2.4.2 绒毛特异基因的富集分析
                2.4.3 生存分析
            2.5 数据库的使用
    结果
        1. 表达谱芯片的总结
        2. 早期绒毛特异性表达的基因执行不同的生物学功能
        3. 绒毛特异性基因在多种肿瘤中表达失调
        4. 免疫、增殖、黏附相关的绒毛特异基因与预后相关
    讨论
    小结
第二部分: 利用人绒毛发育模型鉴别结直肠癌预后生物标志物
    前言
    材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 绒毛样本的收集
            1.2 获取GEO公共数据
            1.3 获取TCGA公共数据
            1.4 细胞系
            1.5 感受态细胞
            1.6 质粒
            1.7 主要的实验仪器与试剂盒及试剂
            1.8 生物信息学分析软件及网站
        2. 实验方法
            2.1 样品mRNA测序
                2.1.1 总RNA提取
                2.1.2 总RNA质量检测及构建文库
                2.1.3 上机测序
            2.2 数据分析
                2.2.1 数据清洗、序列比对及基因表达水平测定
                2.2.2 绒毛和结直肠癌中基因共表达网络的构建及富集分析
                2.2.3 根据“偏离理论”筛选基因
                2.2.4 利用广义线性模型筛选基因
                2.2.5 生存分析
            2.3 免疫组织化学
            2.4 细胞系培养
                2.4.1 细胞复苏
                2.4.2 细胞传代
                2.4.3 细胞冻存
            2.5 表达载体的扩增
                2.5.1 质粒转染大肠杆菌
                2.5.2 大肠杆菌的扩增
                2.5.3 质粒转染细胞株
            2.6 siRNA瞬时转染
            2.7 细胞RNA表达水平检测
                2.7.1 细胞总RNA的提取
                2.7.2 Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA的完整性
                2.7.3 cDNA合成
                2.7.4 实时定量PCR
            2.8 细胞蛋白表达水平检测
                2.8.1 细胞总蛋白提取
                2.8.2 总蛋白定量
                2.8.3 蛋白免疫印迹实验
            2.9 细胞生物学功能实验
                2.9.1 细胞增殖实验-CCK8
                2.9.2 细胞增殖实验-细胞克隆形成
                2.9.3 细胞迁移实验
                2.9.4 细胞凋亡实验
                2.9.5 CHPF参与调节的基因/通路
            2.10 统计学分析
    结果
        1. 早期绒毛和结直肠癌中构建基因共表达网络及功能注释
        2. 鉴别偏离基因
        3. 鉴别在结直肠癌变过程中连续上升或下降的基因
        4. 24个基因与结直肠癌患者预后的相关性
        5. CHPF和MMP14的蛋白表达与预后
        6. CHPF影响结直肠癌细胞的生物学表型
            6.1 CHPF通过抑制结直肠癌细胞的凋亡来促进增殖
            6.2 CHPF促进细胞的迁移
            6.3 CHPF参与的信号通路
    讨论
    小结
第三部分 胎盘绒毛多组学特征基因与泛癌预后的相关性
    前言
    材料与方法
        1 实验材料
            1.1 绒毛样本的收集
            1.2 TCGA公共数据的获取
            1.3 主要实验仪器
            1.4 主要试剂盒及试剂
            1.5 主要溶液及配制方法
            1.6 生物信息学分析软件及网站
        2 实验方法
            2.1 样品mRNA测序
            2.2 样品DNA甲基化Illumina 850K芯片
                2.2.1 抽提组织DNA及纯化
                2.2.2 鉴定DNA质量
                2.2.3 亚硫酸氢盐处理DNA样本
                2.2.4 碱变性及基因组扩增和片段化
                2.2.5 芯片杂交、洗脱及扫描
                2.2.6 甲基化芯片数据分析
            2.3 样品蛋白质谱
                2.3.1 蛋白提取、变性及酶切
                2.3.2 高精度质谱Fusion检测
                2.3.3 MaxQuant软件数据搜库
                2.3.4 质谱数据的分析
            2.4 甲基化数据、转录组数据及蛋白质谱数据整合分析
    结果
        1. 早期绒毛的甲基化呈整体低甲基化
        2. 转录组与甲基化数据相关性分析
        3. 转录组与蛋白质谱数据相关性分析
        4. 多组学数据的整合分析
        5. 19个组学特征基因在泛癌中表达失调并与预后相关
    讨论
    小结
参考文献
附录
基金资助
已发表与学位论文相关的英文论文
文献综述
    参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3797518