脑缺血损伤中星形胶质细胞缝隙连接蛋白43自噬降解的机制及其对神经炎症和细胞凋亡的影响
发布时间：2023-03-23 21:27
背景:在中枢神经系统中,缝隙连接蛋白43(connexin,Cx43)为缝隙连接蛋白的主要的组成成分,Cx43可实现细胞与细胞之间的通讯(特别是神经元与星形胶质细胞,星形胶质细胞与少突胶质细胞之间),并在离子传递、底物交换和传递信息方面起到重要的作用。而缺血性卒中发生后,缝隙连接功能异常,既能传递死亡信号和钙超载,也能传递一些神经保护因子,这一作用十分重要,然而机制尚不明确。近些年的研究表明,缺血后星形胶质细胞细胞膜上Cx43的含量降低,并且内化增加。此外亦有研究证实,在生理条件下内化后的Cx43经自噬选择性降解。以上前期研究的结果为本研究提供了新的思路,即探究缺血后内化的Cx43是否经选择性自噬降解及其详细降解机制,以及干预Cx43自噬降解对神经免疫和细胞凋亡的影响,这使得我们可以通过了解详细的分子机制来寻找更多的治疗干预靶点。目的:探讨脑缺血后Cx43的去向,观察Cx43是否通过细胞自噬途径降解;明确脑缺血后Cx43自噬降解的分子机制;观察促进Cx43自噬降解对脑缺血造成的神经免疫和细胞凋亡的影响,从而判断干预Cx43自噬降解能否能成为治疗缺血性脑损伤的新靶点。方法:体外实验采用原...
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
前言
中文摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第1章 文献综述
1.1 缝隙连接与缝隙连接蛋白 43
1.1.1 Cx43及其构成的缝隙连接与半通道的结构与功能
1.1.2 Cx43及其构成的缝隙连接与半通道的合成、分布及调控机制
1.1.3 Cx43及其构成的缝隙连接、半通道与缺血性疾病
1.2 细胞自噬
1.2.1 自噬的分类
1.2.2 自噬相关分子机制
1.2.3 自噬的病理生理意义
1.3 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬
1.3.1 PINK1和Parkin是线粒体质量控制的关键组成部分
1.3.2 Parkin的结构和功能
1.3.3 PINK1介导的Parkin募集和激活机制
1.3.4 Parkin活化的下游事件和线粒体自噬的分子信号
1.4 缝隙连接的降解途经
1.4.1 蛋白酶体途经
1.4.2 内体/溶酶体途经
1.4.3 自噬/溶酶体途经
1.5 缝隙连接蛋白43与缺血后神经炎症和神经凋亡的关系
1.6 展望
第2章 实验材料与方法技术
2.1 实验器材与试剂
2.1.1 实验器材
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验所需试剂的配制
2.2 统计学分析
2.3 细胞培养
2.3.1 C57BL6小鼠原代星形胶质细胞的培养
2.3.2 Hela细胞系的培养
2.4 实验动物
2.5 实验技术
2.5.1 细胞体外缺血模型的建立
2.5.2 体内缺血模型的建立
2.5.3 细胞转染(过表达)
2.5.4 SiRNA转染
2.5.5 激光共聚焦显微镜观察靶蛋白之间的共定位情况
2.5.6 Western blotting检测靶蛋白表达量的变化
2.5.7 免疫共沉淀Co-IP检测靶蛋白之间的连接情况
第3章 实验结果
3.1 缺血条件下Cx43经自噬降解
3.1.1 Cx43的含量在缺血后降低
3.1.2 在Atg5 KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.1.3 缺血后小鼠星形胶质细胞的Cx43与自噬体膜蛋白LC3b的共定位程度增加
3.1.4 在MCAO后,小鼠脑冰冻切片的Cx43与自噬体膜蛋白LC3b的共定位程度增加
3.2 缺血后Cx43的自噬降解是通过OPTN和NDP52两个自噬受体实现的
3.2.1 缺血后小鼠星形胶质细胞的Cx43与自噬受体OPTN的共定位程度增加
3.2.2 缺血后小鼠星形胶质细胞的Cx43与自噬受体NDP52的共定位程度增加
3.2.3 在MCAO后,小鼠脑冰冻切片的Cx43与OPTN的共定位程度增加
3.2.4 在MCAO后,小鼠脑冰冻切片的Cx43与NDP52的共定位程度增加
3.2.5 在OPTN KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.2.6 在NDP52 KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.2.7 缺血后的小鼠星形胶质细胞的Cx43与OPTN以及NDP52的连接增加
3.2.8 缺血后的HeLa细胞的Cx43与过表达的OPTN以及NDP52的连接增加
3.2.9 缺血后的HeLa细胞的Cx43与过表达的OPTN以及NDP52的共定位增加
3.3 缺血条件下Cx43的自噬降解与PINK1相关,且PINK1是自噬受体的上游蛋白
3.3.1 在PINK1 KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.3.2 在PINK1 KD后,缺血后的Cx43与OPTN以及NDP52的连接降低
3.3.3 缺血后的HeLa细胞的Cx43与过表达的自噬受体以及PINK1三者的共定位增加
3.4 Cx43缺血时的自噬降解与泛素化相关,其结合泛素由p S65-Ub组成
3.4.1 缺血后Cx43的总泛素修饰水平增加
3.4.2 缺血后修饰Cx43的p S65-Ub水平升高
3.5 缺血后Cx43的磷酸化伴随其自噬降解的全过程,是其自噬降解的起点
3.5.1 在Atg5 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.2 在OPTN KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.3 在NDP52 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.4 在PINK1 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.5 缺血后的HeLa细胞的p Cx43(S368)与过表达的OPTN以及NDP52的连接增加
3.5.6 缺血后磷酸化Cx43(S368)的总泛素修饰水平升高
3.5.7 缺血后磷酸化Cx43(S368)的p S65-Ub水平升高
3.5.8 缺血后,S368、Y265和Y247是和Cx43自噬降解的磷酸化位点
3.6 抑制Cx43在缺血后的自噬降解促进了小鼠星形胶质细胞从促炎状态转变为抗炎状态(基于TNF和IL-10 的检测)
3.7 敲低Cx43或加速其自噬降解可降低小鼠星形胶质细胞缺血应激下的细胞凋亡比率
3.8 Atg5、OPTN、NDP52以及PINK1基因的敲低验证
3.9 过表达HA-Ub、RFP-NDP52以及RFP-OPTN的Hela细胞系所进行的免疫共沉淀实验的Input组的western blotting
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所获得的科研成果
致谢
本文编号：3768782
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
前言
中文摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第1章 文献综述
1.1 缝隙连接与缝隙连接蛋白 43
1.1.1 Cx43及其构成的缝隙连接与半通道的结构与功能
1.1.2 Cx43及其构成的缝隙连接与半通道的合成、分布及调控机制
1.1.3 Cx43及其构成的缝隙连接、半通道与缺血性疾病
1.2 细胞自噬
1.2.1 自噬的分类
1.2.2 自噬相关分子机制
1.2.3 自噬的病理生理意义
1.3 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬
1.3.1 PINK1和Parkin是线粒体质量控制的关键组成部分
1.3.2 Parkin的结构和功能
1.3.3 PINK1介导的Parkin募集和激活机制
1.3.4 Parkin活化的下游事件和线粒体自噬的分子信号
1.4 缝隙连接的降解途经
1.4.1 蛋白酶体途经
1.4.2 内体/溶酶体途经
1.4.3 自噬/溶酶体途经
1.5 缝隙连接蛋白43与缺血后神经炎症和神经凋亡的关系
1.6 展望
第2章 实验材料与方法技术
2.1 实验器材与试剂
2.1.1 实验器材
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验所需试剂的配制
2.2 统计学分析
2.3 细胞培养
2.3.1 C57BL6小鼠原代星形胶质细胞的培养
2.3.2 Hela细胞系的培养
2.4 实验动物
2.5 实验技术
2.5.1 细胞体外缺血模型的建立
2.5.2 体内缺血模型的建立
2.5.3 细胞转染(过表达)
2.5.4 SiRNA转染
2.5.5 激光共聚焦显微镜观察靶蛋白之间的共定位情况
2.5.6 Western blotting检测靶蛋白表达量的变化
2.5.7 免疫共沉淀Co-IP检测靶蛋白之间的连接情况
第3章 实验结果
3.1 缺血条件下Cx43经自噬降解
3.1.1 Cx43的含量在缺血后降低
3.1.2 在Atg5 KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.1.3 缺血后小鼠星形胶质细胞的Cx43与自噬体膜蛋白LC3b的共定位程度增加
3.1.4 在MCAO后,小鼠脑冰冻切片的Cx43与自噬体膜蛋白LC3b的共定位程度增加
3.2 缺血后Cx43的自噬降解是通过OPTN和NDP52两个自噬受体实现的
3.2.1 缺血后小鼠星形胶质细胞的Cx43与自噬受体OPTN的共定位程度增加
3.2.2 缺血后小鼠星形胶质细胞的Cx43与自噬受体NDP52的共定位程度增加
3.2.3 在MCAO后,小鼠脑冰冻切片的Cx43与OPTN的共定位程度增加
3.2.4 在MCAO后,小鼠脑冰冻切片的Cx43与NDP52的共定位程度增加
3.2.5 在OPTN KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.2.6 在NDP52 KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.2.7 缺血后的小鼠星形胶质细胞的Cx43与OPTN以及NDP52的连接增加
3.2.8 缺血后的HeLa细胞的Cx43与过表达的OPTN以及NDP52的连接增加
3.2.9 缺血后的HeLa细胞的Cx43与过表达的OPTN以及NDP52的共定位增加
3.3 缺血条件下Cx43的自噬降解与PINK1相关,且PINK1是自噬受体的上游蛋白
3.3.1 在PINK1 KD后,缺血后的Cx43含量出现了蓄积
3.3.2 在PINK1 KD后,缺血后的Cx43与OPTN以及NDP52的连接降低
3.3.3 缺血后的HeLa细胞的Cx43与过表达的自噬受体以及PINK1三者的共定位增加
3.4 Cx43缺血时的自噬降解与泛素化相关,其结合泛素由p S65-Ub组成
3.4.1 缺血后Cx43的总泛素修饰水平增加
3.4.2 缺血后修饰Cx43的p S65-Ub水平升高
3.5 缺血后Cx43的磷酸化伴随其自噬降解的全过程,是其自噬降解的起点
3.5.1 在Atg5 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.2 在OPTN KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.3 在NDP52 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.4 在PINK1 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出现了蓄积
3.5.5 缺血后的HeLa细胞的p Cx43(S368)与过表达的OPTN以及NDP52的连接增加
3.5.6 缺血后磷酸化Cx43(S368)的总泛素修饰水平升高
3.5.7 缺血后磷酸化Cx43(S368)的p S65-Ub水平升高
3.5.8 缺血后,S368、Y265和Y247是和Cx43自噬降解的磷酸化位点
3.6 抑制Cx43在缺血后的自噬降解促进了小鼠星形胶质细胞从促炎状态转变为抗炎状态(基于TNF和IL-10 的检测)
3.7 敲低Cx43或加速其自噬降解可降低小鼠星形胶质细胞缺血应激下的细胞凋亡比率
3.8 Atg5、OPTN、NDP52以及PINK1基因的敲低验证
3.9 过表达HA-Ub、RFP-NDP52以及RFP-OPTN的Hela细胞系所进行的免疫共沉淀实验的Input组的western blotting
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所获得的科研成果
致谢
本文编号：3768782
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