ANXA2及相关miRNAs在结直肠癌发生发展中的作用及与肝癌靶向治疗关系的研究
发布时间：2023-02-19 18:42
背景与目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)和肝癌(Hepatocellular cancer,HCC)是世界上常见的恶性肿瘤,在中国发病率和死亡率均很高。膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)在多种肿瘤组织高表达,促进肿瘤的恶性发展特质如癌细胞增殖及侵袭转移强化等。研究发现ANXA2也在CRC和HCC中高表达,ANXA2在CRC的发展过程中可能是一个关键性基因表达异化事件之一,而且可能存在一条ANXA2信号通路。ANXA2在29.5%的被调查CRC病例中高表达,并且与肿瘤生长和转移侵袭等密切相关。ANXA2活化是其发挥信号转导作用的基础,文献表明ANXA2活化的重要功能域位于其N末端,但是,其N端关键性氨基酸位点在肿瘤发生、发展过程中的作用机制报道极少。进一步深入研究ANXA2蛋白N端关键位点对理解其信号通路调节及其与肿瘤发生发展的关系具有重要意义。在前期构建的ANXA2人结直肠癌敲除细胞系(ANXA2-/-caco2)的基础之上,我们以单点突变(Site directed mutation)和多点突变(Multiple sites directed ...
【文章页数】：147 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词一览表
第1章 绪论
1.1 结直肠癌及其研究现状
1.1.1 结直肠癌的发生及发病率
1.1.2 结直肠癌的诊断、治疗
1.2 ANXA家族及ANXA2
1.2.1 ANXA家族
1.2.2 ANXA2与肿瘤发生和发展的关系
1.2.3 ANXA2关键位点及其信号通路激活
1.3 肝癌的靶向治疗
1.3.1 阿霉素药物研究现状
1.3.2 肝癌靶向多肽研究现状
1.4 miRNA与肝癌
1.4.1 miRNA概述
1.4.2 肝癌有关miRNAs的研究进展
1.4.3 肝癌MDR相关miRNAs的研究动态
1.5 选题依据与研究思路
1.5.1 ANXA2在结直肠癌中的分子构效与调控研究
1.5.2 肝癌靶向药物递送体系研究
第2章 ANXA2与结直肠癌和肝癌恶性程度的关系
2.1 实验材料、试剂与仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 试剂的配制
2.2 实验方法
2.2.1 ANXA2在肿瘤临床样本中的变异
2.2.2 ANXA2在CRC和HCC临床样本中的变异
2.2.3 ANXA2在CRC和HCC临床发展中的作用分析
2.2.4 石蜡片免疫荧光染色
2.3 实验结果
2.3.1 ANXA2在肿瘤临床样本中的变异
2.3.2 ANXA2在CRC和HCC临床样本中的变异
2.3.3 ANXA2增强CRC和HCC发展
2.3.4 ANXA2在结肠癌和肝癌临床组织的表达
2.3.5 ANXA2在结肠癌和肝癌组织芯片的表达
2.3.6 ANXA2表达与结肠癌和肝癌恶性程度相关分析
2.4 讨论
2.5 小结
第3章 ANXA2 N端关键位点在结直肠癌发展中的作用研究
3.1 实验材料、试剂与仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 试剂的配制
3.2 实验方法
3.2.1 ANXA2 N端点突变引物设计
3.2.2 ANXA2 N端点突变PCR反应
3.2.3 质粒浓度与纯度测定
3.2.4 细胞培养
3.2.5 细胞转染
3.2.6 Western Blot
3.2.7 MTT法检测细胞增殖
3.2.8 细胞周期检测
3.2.9 细胞运动及迁移能力检测
3.2.10 细胞F-actin检测
3.2.11 细胞β-tubulin检测
3.2.12 细胞骨架整体形态结构检测
3.2.13 扫描电子显微镜检测
3.2.14 透射电子显微镜检测
3.2.15 统计分析
3.3 实验结果
3.3.1 阳性克隆的制备和检测
3.3.2 细胞转染效率评估
3.3.3 Western Blot检测ANXA2 N端各突变点磷酸化水平
3.3.4 ANXA2 N端点突变对caco2细胞增殖的影响
3.3.5 ANXA2 N端点突变对caco2细胞周期的影响
3.3.6 ANXA2 N端点突变对caco2细胞运动及迁移能力的影响
3.3.7 ANXA2 N端点突变对caco2细胞F-actin和β-tubulin聚合的影响
3.3.8 ANXA2 N端点突变对caco2细胞运动相关微结构的影响
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 miR-206对ANXA2在结直肠癌发生发展中的调控研究
4.1 实验材料、试剂与仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 实验试剂
4.1.3 主要仪器设备(同第3章)
4.1.4 试剂的配制(同第3章)
4.2 实验方法
4.2.1 靶向ANXA2的miRNAs预测
4.2.2 miRNA前体基因DNA插入片段设计
4.2.3 pcDNA6.2-GW和pmirGLO质粒载体小量制备
4.2.4 pcDNA6.2-GW质粒载体胶纯化回收
4.2.5 pre-miRNA双链形成
4.2.6 pcDNA6.2-GW/miRNA质粒的构建
4.2.7 ANXA2的3'UTR设计与合成
4.2.8 ANXA2 3'UTR双荧光素报告基因载体的构建
4.2.9 双荧光素酶报告基因实验
4.2.10 细胞平板克隆形成实验
4.2.11 细胞增殖、细胞周期、细胞运动及迁移能力、细胞凋亡的形态学、细胞骨架整体形态结构的检测
4.2.12 EMT相关基因Western Blot检测
4.2.13 统计分析
4.3 实验结果
4.3.1 靶向ANXA2的miRNAs预测
4.3.2 阳性克隆的鉴定和制备
4.3.3 miR-206、miR-1-3p和miR-613与ANXA2 3'UTR靶向关系验证
4.3.4 miR-206抑制ANXA2蛋白水平的表达
4.3.5 过表达miR-206抑制caco2细胞增殖
4.3.6 过表达miR-206对caco2细胞周期的影响
4.3.7 过表达miR-206抑制caco2细胞运动
4.3.8 过表达miR-206对caco2细胞凋亡的影响
4.3.9 过表达miR-206对caco2细胞骨架整体形态结构的影响
4.3.10 过表达miR-206抑制caco2细胞EMT的发生
4.4 讨论
4.5 小结
第5章 肝癌靶向药物递送体系的构建及其对ANXA2和体内肿瘤生长的抑制效应
5.1 实验材料、试剂与仪器
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验试剂
5.1.3 主要仪器设备
5.1.4 试剂的配制
5.2 实验方法
5.2.1 miRNA的选择
5.2.2 miR-101种子区与MDR关键基因3,UTR的靶点分析
5.2.3 miR-101前体基因DNA插入片段设计
5.2.4 pcDNA6.2-GW质粒载体小量制备、胶纯化回收、pre-miR-101双链的形成、pcDNA6.2-GW/miR-101质粒的构建及小量制备
5.2.5 PEG与多肽反应
5.2.6 多肽靶向阳离子脂质体制备
5.2.7 载DOX
5.2.8 载DNA
5.2.9 HCSP4-Lipo-DOX-miR101粒径、分散系数以及包封率检测
5.2.10 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的微结构观察
5.2.11 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性检测
5.2.12 裸鼠分组
5.2.13 细胞接种
5.2.14 药物注射
5.2.15 动物处死及解剖
5.2.16 统计分析
5.3 实验结果
5.3.1 ANXA2与miR-101的靶向关系分析
5.3.2 miR-101与MDR相关基因的靶点分析
5.3.3 pcDNA6.2-GW/miR-101阳性克隆的鉴定和制备
5.3.4 HCSP4-Lipo-DOX-miR101粒径、分散系数以及药物包封率检测
5.3.5 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的微观形态观察
5.3.6 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的细胞转染效率评估
5.3.7 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性检测
5.3.8 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对肝癌细胞ANXA2蛋白水平的影响
5.3.9 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤生长的影响
5.3.10 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤体积的影响
5.3.11 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤重量的影响
5.3.12 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤转移力的影响
5.3.13 ANXA2在裸鼠HCC移植瘤中的表达及作用分析
5.4 讨论
5.5 小结
第6章 全文总结与展望
参考文献
致谢
攻读博士学位期间的科研成果
本文编号：3746754
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【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
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第1章 绪论
1.1 结直肠癌及其研究现状
1.1.1 结直肠癌的发生及发病率
1.1.2 结直肠癌的诊断、治疗
1.2 ANXA家族及ANXA2
1.2.1 ANXA家族
1.2.2 ANXA2与肿瘤发生和发展的关系
1.2.3 ANXA2关键位点及其信号通路激活
1.3 肝癌的靶向治疗
1.3.1 阿霉素药物研究现状
1.3.2 肝癌靶向多肽研究现状
1.4 miRNA与肝癌
1.4.1 miRNA概述
1.4.2 肝癌有关miRNAs的研究进展
1.4.3 肝癌MDR相关miRNAs的研究动态
1.5 选题依据与研究思路
1.5.1 ANXA2在结直肠癌中的分子构效与调控研究
1.5.2 肝癌靶向药物递送体系研究
第2章 ANXA2与结直肠癌和肝癌恶性程度的关系
2.1 实验材料、试剂与仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 试剂的配制
2.2 实验方法
2.2.1 ANXA2在肿瘤临床样本中的变异
2.2.2 ANXA2在CRC和HCC临床样本中的变异
2.2.3 ANXA2在CRC和HCC临床发展中的作用分析
2.2.4 石蜡片免疫荧光染色
2.3 实验结果
2.3.1 ANXA2在肿瘤临床样本中的变异
2.3.2 ANXA2在CRC和HCC临床样本中的变异
2.3.3 ANXA2增强CRC和HCC发展
2.3.4 ANXA2在结肠癌和肝癌临床组织的表达
2.3.5 ANXA2在结肠癌和肝癌组织芯片的表达
2.3.6 ANXA2表达与结肠癌和肝癌恶性程度相关分析
2.4 讨论
2.5 小结
第3章 ANXA2 N端关键位点在结直肠癌发展中的作用研究
3.1 实验材料、试剂与仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 试剂的配制
3.2 实验方法
3.2.1 ANXA2 N端点突变引物设计
3.2.2 ANXA2 N端点突变PCR反应
3.2.3 质粒浓度与纯度测定
3.2.4 细胞培养
3.2.5 细胞转染
3.2.6 Western Blot
3.2.7 MTT法检测细胞增殖
3.2.8 细胞周期检测
3.2.9 细胞运动及迁移能力检测
3.2.10 细胞F-actin检测
3.2.11 细胞β-tubulin检测
3.2.12 细胞骨架整体形态结构检测
3.2.13 扫描电子显微镜检测
3.2.14 透射电子显微镜检测
3.2.15 统计分析
3.3 实验结果
3.3.1 阳性克隆的制备和检测
3.3.2 细胞转染效率评估
3.3.3 Western Blot检测ANXA2 N端各突变点磷酸化水平
3.3.4 ANXA2 N端点突变对caco2细胞增殖的影响
3.3.5 ANXA2 N端点突变对caco2细胞周期的影响
3.3.6 ANXA2 N端点突变对caco2细胞运动及迁移能力的影响
3.3.7 ANXA2 N端点突变对caco2细胞F-actin和β-tubulin聚合的影响
3.3.8 ANXA2 N端点突变对caco2细胞运动相关微结构的影响
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 miR-206对ANXA2在结直肠癌发生发展中的调控研究
4.1 实验材料、试剂与仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 实验试剂
4.1.3 主要仪器设备(同第3章)
4.1.4 试剂的配制(同第3章)
4.2 实验方法
4.2.1 靶向ANXA2的miRNAs预测
4.2.2 miRNA前体基因DNA插入片段设计
4.2.3 pcDNA6.2-GW和pmirGLO质粒载体小量制备
4.2.4 pcDNA6.2-GW质粒载体胶纯化回收
4.2.5 pre-miRNA双链形成
4.2.6 pcDNA6.2-GW/miRNA质粒的构建
4.2.7 ANXA2的3'UTR设计与合成
4.2.8 ANXA2 3'UTR双荧光素报告基因载体的构建
4.2.9 双荧光素酶报告基因实验
4.2.10 细胞平板克隆形成实验
4.2.11 细胞增殖、细胞周期、细胞运动及迁移能力、细胞凋亡的形态学、细胞骨架整体形态结构的检测
4.2.12 EMT相关基因Western Blot检测
4.2.13 统计分析
4.3 实验结果
4.3.1 靶向ANXA2的miRNAs预测
4.3.2 阳性克隆的鉴定和制备
4.3.3 miR-206、miR-1-3p和miR-613与ANXA2 3'UTR靶向关系验证
4.3.4 miR-206抑制ANXA2蛋白水平的表达
4.3.5 过表达miR-206抑制caco2细胞增殖
4.3.6 过表达miR-206对caco2细胞周期的影响
4.3.7 过表达miR-206抑制caco2细胞运动
4.3.8 过表达miR-206对caco2细胞凋亡的影响
4.3.9 过表达miR-206对caco2细胞骨架整体形态结构的影响
4.3.10 过表达miR-206抑制caco2细胞EMT的发生
4.4 讨论
4.5 小结
第5章 肝癌靶向药物递送体系的构建及其对ANXA2和体内肿瘤生长的抑制效应
5.1 实验材料、试剂与仪器
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验试剂
5.1.3 主要仪器设备
5.1.4 试剂的配制
5.2 实验方法
5.2.1 miRNA的选择
5.2.2 miR-101种子区与MDR关键基因3,UTR的靶点分析
5.2.3 miR-101前体基因DNA插入片段设计
5.2.4 pcDNA6.2-GW质粒载体小量制备、胶纯化回收、pre-miR-101双链的形成、pcDNA6.2-GW/miR-101质粒的构建及小量制备
5.2.5 PEG与多肽反应
5.2.6 多肽靶向阳离子脂质体制备
5.2.7 载DOX
5.2.8 载DNA
5.2.9 HCSP4-Lipo-DOX-miR101粒径、分散系数以及包封率检测
5.2.10 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的微结构观察
5.2.11 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性检测
5.2.12 裸鼠分组
5.2.13 细胞接种
5.2.14 药物注射
5.2.15 动物处死及解剖
5.2.16 统计分析
5.3 实验结果
5.3.1 ANXA2与miR-101的靶向关系分析
5.3.2 miR-101与MDR相关基因的靶点分析
5.3.3 pcDNA6.2-GW/miR-101阳性克隆的鉴定和制备
5.3.4 HCSP4-Lipo-DOX-miR101粒径、分散系数以及药物包封率检测
5.3.5 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的微观形态观察
5.3.6 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的细胞转染效率评估
5.3.7 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性检测
5.3.8 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对肝癌细胞ANXA2蛋白水平的影响
5.3.9 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤生长的影响
5.3.10 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤体积的影响
5.3.11 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤重量的影响
5.3.12 HCSP4-Lipo-DOX-miR101对裸鼠HCC移植瘤转移力的影响
5.3.13 ANXA2在裸鼠HCC移植瘤中的表达及作用分析
5.4 讨论
5.5 小结
第6章 全文总结与展望
参考文献
致谢
攻读博士学位期间的科研成果
本文编号：3746754
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3746754.html
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