RGD靶向微泡与载药微球在肝脏创伤渗血诊断和治疗中的研究

发布时间：2016-11-10 13:46

  本文关键词：RGD靶向微泡与载药微球在肝脏创伤渗血诊断和治疗中的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《中国人民解放军医学院》 2015年

RGD靶向微泡与载药微球在肝脏创伤渗血诊断和治疗中的研究

周璇  

【摘要】：第一部分靶向造影微泡制备及其在肝脏创伤渗血诊断中的研究目的制备三种超声造影剂：普通脂质微泡(MBMal)、靶向脂质微泡(MBRGD)和对照脂质微泡(MBRAD),分别对其性质进行检测,并通过动物实验研究MBRGD在肝脏创伤渗血诊断中的价值。方法(1)采用机械震荡法制备各型MB,对其进行形态、分散性、粒径、电位、计数、多肽连接率、多肽连接量的观察和测定;(2)对各型MB进行体内外增强显影;(3)各型MB体外寻靶能力的观察;(4)对12只新西兰兔分成两组进行肝脏创伤造模,造模后两组均首先静脉注射MBMal,超声造影(CEUS)观察10 min,证明无活动性出血但实际未完全止血情况下,实验组注射MBRGD,对照组注射MBRAD,观察病灶区域造影剂灌注状况,共计10min,脱机分析数据,每隔1 min应用DFY软件测量感兴趣区的平均灰度值(AGVs),分别与其之前的MBMal造影图像作对比分析。结果(1)三种MB光镜下观察大小基本一致,分布均匀,分散性较好；MBMal、MBRGD及MBRAD的平均粒径分别为：4.25±0.67μm,3.71±0.58μm,4.18±0.86μm;平均电位分别为：0.01±7.86mV,-37.3±3.44mV,-34.5±5.21mV;浓度分别是：2.52±0.26×108个/mL,2.74±0.12×108个/mL,2.34±0.46×108个/mL;MBRGD多肽结合率为98.62%,MBRAD的多肽结合率为98.94%;多肽连接量分别是9.76±0.91×104个RGD/MBRGD,10.13±0.34×104个RAD/MBRAD。(2)三种MB均在105数量级浓度时,增强显影效果最佳,相同数量级浓度条件下三种MB的AGVs统计无明显差异(P值均大于0.05)。体内增强显影开始于注射后10s左右,持续时间均在10 min左右,三种MB在相同时间点的平均灰度值均无明显差异(P值均大于0.05)。(3)镜下观察MBRGD明显聚集于活化凝集的血小板周围或内部;MBMal与MBRGD与活化的血小板无明显团聚或粘附现象。(4)每组中均有5只动物模型制作成功。实验组CEUS显示MBRGD在创伤区域聚集,而对照组未见MBRAD聚集显影。实验组MBRGD较之于空白微泡MBMal在CEUS早期即1-3 min的表现相似,创伤灶的AGVs相比无统计学意义,P1min、P2min、P3min均大于0.05;自第4min开始,MBRGD开始在创伤灶内有少量聚集,至第6min,MBRGD进行CEUS的AGVs较之于MBMal均有统计学意义,P4min、 P5min0.01, P6min0.05;第7min时两者的AGVs比较无统计学意义,P7min0.05;第8、9min时MBRGD的AGVs较前降低,但较之于MBMal仍有统计学意义,P8min 0.05, P9min0.05;至第10min时,两者的AGVs比较无统计学差异,P10min0.05。对照组MBRAD较之于空白微泡MBMal在各个时间点的AGVs比较均无统计学差异,P值均大于0.05。靶向微泡MBRGD与阴性对照微泡MBRGD进行CEUS的AGVs在各个时间点相比,第4、10min比较差异无统计学意义,P4min0.05,P10min0.05;其余时间点比较则均有统计学意义,其中,第2、3、6、8min比较差异有显著统计学意义,P2min、P3min、P6min、P8min0.01;第1、5、7、9 min比较差异有统计学意义,P1min、P5min、P7min、P9min0.05。结论机械振荡法制备RGD靶向脂质微泡方法简单,成泡率高,粒径均一,分散度好,体外靶向性好,体内外显影效果好,对于渗血可以靶向显影,可尝试作为诊断肝脏创伤渗血的对比显影剂,为临床诊断提供新思路。第二部分载氨甲环酸靶向微球的制备及其在肝脏创伤渗血治疗中的研究目的制备四种高分子材料微球：载氨甲环酸靶向微球(PLGA-TXA-RGD),载氨甲环酸空白微球(PLGA-TXA),载氨甲环酸非靶向微球(PLGA-TXA-RAD),非载药靶向微球(PLGA-RGD),并对其性质进行检测,通过动物实验研究PLGA-TXA-RGD对肝脏创伤渗血的治疗价值。方法(1)采用双乳化法制备各型PLGA微球,对其进行形态、分散性、结构、粒径、电位、多肽连接率、载药量、包封率及释药率进行观察及测定;(2)48只雄性SD大鼠随机分为6组：生理盐水组(N.S),静脉注射TXA组(I.V TXA), PLGA-TXA-RGD组,PLGA-TXA组,PLGA-TXA-RGD组,PLGA-RGD组;肝脏创伤造模后经尾静脉缓慢注射各组试剂0.5 ml,自造模开始至渗血结束,记录出血量、出血时间、干增重及3h内死亡率,对各组数据进行统计学分析。(3)创伤灶处组织行冰冻切片处理,荧光显微镜下观察创伤灶切口边缘及血凝块中PLGA微球的情况。结果(1)光镜下观察各组PLGA微球粒径较均匀,分散性好,无团聚现象;透射电镜观察到微球的结构为球形,可见其壳样结构,欠光滑;PLGA-TXA-RGD, PLGA-TXA, PLGA-TXA-RAD, PLGA-RGD四种PLGA微球的平均粒径分别是1811±369.4nm,1747±276.7nm,1831±268.3 nm,1909±305.4nm;平均电位分别是-24.7±4.4 mV,-24.3±4.49mV,-24.6±3.61 mV,-25.5±4.28 mV;流式细胞仪检测载药PLGA微球连接RGD和RAD多肽的连接率分别是92.88%和93.85%;载药PLGA微球的包封率为18.5±2.4%,载药量为3.7±0.5%。3 h时超声辐照组的释药率达到27.3±1.1%,非超声辐照组的释药率达到20.0±1.6%。 (2)比较各组出血时间(t)、出血量(W)、出血量干增重(W’),P值均小于0.01,差异有显著统计学意义。组间进行两两比较,I.V TXA组与N.S组在t、W、W’上均有统计学差异,P值均小于0.05。对t进行两两比较时,PLGA-TXA-RGD组分别与I.V TXA组、PLGA-RGD组相比,P0.05,差异无统计学意义,与PLGA-TXA-RAD组相比,P0.01,差异有显著统计学意义。对W进行两两比较时,PLGA-TXA-RGD组与PLGA-RGD相比,P0.05,差异无统计学意义；与I.V TXA组相比,P0.05,差异有统计学意义;与PLGA-TXA、PLGA-TXA-RAD相比,P0.01,差异有显著统计学意义。对W’进行两两比较时,比较结果同W组。比较各组死亡率,P0.05,差异无统计学意义；两两比较,P0.05,差异无统计学意义。(3) PLGA-TXA组与PLGA-TXA-RAD组的创面边缘未见大量的红色荧光微球聚集成带状,仅在血凝块内部观察到红色荧光。PLGA-RGD组与PLGA-TXA-RGD组的创面边缘可见橙红色荧光微球聚集,数量较多,形成带状,在靠近创面边缘形成血凝块的部位可见红色荧光微球聚集。结论双乳化法制作的载氨甲环酸靶向PLGA微球粒径均匀,分散性好,包封率及载药量可,其具备靶向及载药双重功能,可作为止血剂静脉注射用于肝脏创伤后渗血治疗。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3
【目录】：

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