羊草Ca 2+ 依赖生长机理及特有组氨酸富集Ca 2+ 结合蛋白HRC功能研究

发布时间：2024-03-15 19:36

　　钙是植物生长发育必需大量元素之一,通过调节不同Ca²⁺结合蛋白的活性,发挥维持细胞结构和介导细胞感应内外环境信号的功能。生态学研究发现,酸雨导致全球表层土壤游离Ca²⁺含量逐年下降,森林植物和淡水生物生存受到威胁。内蒙古草原土壤从东到西,有机质含量逐渐降低,可溶性Ca²⁺含量也随之降低。羊草是包括内蒙古草原在内的、欧亚草原优势建群种。目前,羊草如何应对生理性缺Ca²⁺环境,是否具有专属Ca²⁺结合蛋白,基本未知。本文在建立羊草无菌培养和基因瞬时表达实验体系的基础上,深入研究了羊草Ca²⁺依赖性生长的细胞和分子机理,进一步探索了羊草特有组氨酸富集Ca²⁺结合蛋白的生理功能,主要结论和成果如下:(1)羊草无菌培养和基因瞬时表达技术体系的建立。本论文用不同消毒剂对羊草种子进行不同时间的消毒,建立了羊草种子无菌条件下均一发芽的实验方法,可使羊草种子发芽率达到90%以上,无染菌。基本消毒剂配方:5%NaClO+0.1%Triton X-100。...

【文章页数】：157 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 植物CA²⁺研究进展及研究羊草CA²⁺吸收、分布的意义
    1 植物钙研究进展
        1.1 植物中Ca²⁺的吸收和运输
        1.2 植物中的钙主要储存在液泡、内质网和质外体
        1.3 Ca²⁺作为结构分子在植物生长发育过程中起重要作用
            1.3.1 Ca²⁺和细胞壁的硬度
            1.3.2 Ca²⁺和细胞质膜的通透性
        1.4 Ca²⁺作为信号分子在植物生长发育过程中起重要作用
            1.4.1 特异性Ca²⁺信号
            1.4.2 Ca²⁺信号的解码
            1.4.3 Ca²⁺的内流
            1.4.4 Ca²⁺的外流
    2 研究羊草Ca²⁺吸收、分布的意义
        2.1 全球范围内表层土壤植物可利用Ca²⁺在减少
        2.2 羊草中Ca²⁺的吸收及分布还未见报道
第二章 羊草CA²⁺依赖生长机理及特有组氨酸富集CA²⁺结合蛋白功能研究
    1.引言
    2.材料和方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 植物材料
            2.1.2 菌种
            2.1.3 主要仪器
            2.1.4 相关试剂及溶液的配制
            2.1.5 相关引物信息
        2.2 实验方法及原理
            2.2.1 羊草种子最佳无菌发芽条件的探究
            2.2.2 羊草瞬时表达实验体系的建立
            2.2.3 羊草不同培养基上生长的生理学分析
            2.2.4 细胞学染料染色实验及免疫荧光实验
            2.2.5 转录组测序实验
            2.2.6 LcHRC1基因全长的克隆实验
            2.2.7 LcHRC1蛋白短肽离子结合特性分析
            2.2.8 DH5α大肠杆菌感受态制备
            2.2.9 GV3101/C58C1农杆菌感受态制备
            2.2.10 Y187/Y2HGold酵母感受态制备
            2.2.11 表达载体的构建
            2.2.12 表达载体质粒转化农杆菌感受态
            2.2.13 表达载体质粒转化酵母感受态
            2.2.14 酵母双杂交实验
            2.2.15 蛋白的亚细胞定位实验
            2.2.16 获取转LcHRC1基因拟南芥材料
            2.2.17 拟南芥不同培养基上生长的生理学分析
            2.2.18 拟南芥干旱处理实验
            2.2.19 监测拟南芥材料叶[Ca²⁺]cyt瞬时变化实验
            2.2.20 半定量及定量实验
            2.2.21 拟南芥ABA含量测定
    3.结果与分析
        3.1 羊草种子最佳无菌发芽条件为5%NaClO+0.1%Triton-X100消毒2h后避光发芽
            3.1.1 5%NaClO+0.1%TritonX-100是羊草种子首选消毒剂
            3.1.2 5%NaClO+0.1%Triton-X100消毒完整羊草种子的最佳时间为2h
        3.2 农杆菌成功介导红色荧光蛋白基因在羊草叶片表达
        3.3 低Ca²⁺特异性诱导羊草主根伸长
        3.4 细胞学染料染色实验证明低Ca²⁺诱导羊草根积累H2O2和TAG
        3.5 低浓度H2O2诱导羊草主根伸长,抑制羊草根毛生长
        3.6 转录组测序实验探究低Ca²⁺特异性诱导羊草主根伸长的分子机理
        3.7 免疫荧光实验证明低Ca²⁺培养基上生长的羊草根半纤维素含量增加
        3.8 羊草特有Ca²⁺结合蛋白的分析
        3.9 LcHRC1基因全长的克隆及组织特异性表达分析
            3.9.1 LcHRC1基因编码区序列没有内含子
            3.9.2 LcHRC1基因启动子区有CpG岛元件,启动LcHRC1在羊草叶片、根中表达
        3.10 LcHRC1蛋白片段有Ca²⁺和Zn2+结合特性
        3.11 酵母双杂交实验证明拟南芥AtTPM1蛋白与LcHRC1蛋白相互作用
            3.11.1 LcHRC1蛋白对酵母菌Y2HGold的生长没有毒性
            3.11.2 LcHRC1蛋白不能自激活报告基因的表达
            3.11.3 酵母筛库实验证明拟南芥AtTPM1蛋白可能与LcHRC1蛋白相互作用
            3.11.4 酵母双杂交实验证明拟南芥AtTPM1蛋白确实与LcHRC1蛋白相互作用
        3.12 羊草LcTPM1蛋白与LcHRC1蛋白相互作用
        3.13 LcHRC1蛋白定位在细胞核
            3.13.1 LcHRC1-GFP融合蛋白在烟草叶片细胞核表达
            3.13.2 LcHRC1-GFP融合蛋白在羊草叶片细胞核表达
        3.14 LcHRC1互作蛋白LcTPM1定位在细胞核
        3.15 转LcHRC1基因拟南芥的生长对ABA敏感
        3.16 LcHRC1不参与ABA代谢
        3.17 LcHRC1参与ABA依赖信号通路
        3.18 LcHRC1参与ABA依赖信号通路对干旱胁迫的应答
        3.19 ABA处理拟南芥叶片转LcHRC1基因拟南芥[Ca²⁺]cyt升高倍数低于野生型
        3.20 ABA抑制羊草叶片中LcHRC1基因的表达
    4.讨论
    5.结论
参考文献
附录
    附录一：英文缩略词
    附录二：羊草转录组测序数据分析到的Ca²⁺结合蛋白及其相关蛋白统计
    附录三：LcHRC1基因侧翼未知序列及LcHRC1基因序列
致谢
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本文编号：3928766