软腐果胶杆菌Hfq蛋白及sRNAs在致病过程中的功能研究
发布时间：2023-06-01 18:29
果胶杆菌属(Pactobbbacterium)细菌寄主范围广泛,在寄主植物上造成枯萎、腐烂及黑胫症状,是农业生产中十大植物病原细菌之一。果胶杆菌可以外泌一系列植物细胞壁降解酶类(PCWDEs),这些酶类是其重要的致病因子。其中,胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorum subsp.carotovorum)的寄主范围最为广泛,可以侵染200多种植物,包括具有重要经济价值的蔬菜及花卉,例如马铃薯、白菜等。随着中国马铃薯主粮化的推进,对此类可造成马铃薯严重经济损失的植物病原细菌的致病机理研究具有非常重要的意义。Hfq作为一类全局调控蛋白,广泛存在于革兰氏阴性及阳性细菌中。在动物致病菌中大量研究表明,其参与调控了多个细胞过程及代谢途径,对大多数细菌的致病能力均有影响,但是有关Hfq蛋白在植物致病菌中的研究较少。为了探究Hfq在P.carotovorum subsp.carotovorum PccS 1中的致病相关功能,本研究通过同源重组的方法构建了 Hfq缺失突变体,致病性测定结果表明Δhfq的致病能力几乎完全丧失,生物学表型分析结果显示物缺失突变株的胞外酶分泌显著减少,与此同...
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
上篇 文献综述
1 软腐肠杆菌概述
2 软腐果胶杆菌致病因子
2.1 胞外植物细胞壁降解酶
3 Ⅵ分泌系统
3.1 Ⅵ分泌系统的组成
4 Hfq蛋白的研究
4.1 Hfq的结构
4.2 Hfq蛋白对细菌毒力的影响
4.3 Hfq蛋白多效性作用
4.4 Hfq蛋白对Ⅲ型分泌系统的调控
4.5 Hfq对基因的全局调控作用
4.6 Hfq与靶标sNA
5 细菌sRNAs的研究
5.1 sRNA调控蛋白活性
5.2 基于碱基互补配对调控的sRNAs
6 ArcZ研究进展
6.1 ArcZ促进rpoS的翻译
6.2 ArcZ抑制flhDC的翻译
6.3 ArcZ对其他基因的调控作用
7 本文研究的目的及与意义
下篇 研究内容
第一章 软腐果胶杆菌Hfq蛋白的功能研究
1 引言
2 供试材料
2.1 本研究所用菌株、质粒和引物
3 试验方法
3.1 菌株培养
3.2 细菌基因组DNA提取
3.3 质粒的提取
3.4 细菌RNA的提取
3.5 DNA回收
3.6 DNA片段和质粒的酶切、回收及连接反应
3.7 质粒DNA的转化
3.8 缺失突变体及互补菌株的构建
3.9 生物学表型测定
3.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
3.11 转录组测序及分析
3.12 Western blot杂交检测
3.13 寄主植物胼胝质沉积的检测
4 结果与分析
4.1 目的基因的比对
4.2 hfq缺失突变株及其互补菌株的构建
4.3 hfq缺失突变株的致病能力显著下降
4.4 Hfq对菌株PccS1生长能力的影响
4.5 hfq缺失突变株的胞外酶产量降低
4.6 hfq缺失突变株的碳青霉烯抗生素活性降低
4.7 hfq缺失突变株的游动性及生物膜产生能力下降
4.8 Hfq抑制病原体相关分子诱导的寄主植物的胼胝质沉积
4.9 Hfq促进Hcp蛋白的分泌及T6SS基因簇基因的表达
4.10 Hfq对菌株PccS1基因的全局调控作用
5 小结与讨论
第二章 软腐果胶杆菌sRNAs的功能研究
1 引言
2 实验材料
2.1 本研究所用菌株、质粒和引物
3 试验方法
3.1 菌株培养
3.2 细菌基因组DNA提取
3.3 质粒提取
3.4 细菌RNA的提取
3.5 DNA回收
3.6 DNA片段和质粒的酶切、回收及连接反应
3.7 质粒DNA的热激转化
3.8 突变体及其互补菌株的构建
3.9 生物学表型测定
3.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
3.11 Western blot杂交检测
4 结果与分析
4.1 sRNAs的预测
4.2 sRNAs缺失突变体的构建
4.3 ArcZ,CsrB,SraG缺失对菌株PccS1致病能力具有显著影响
4.4 ArcZ序列比对
4.5 ArcZ互补及过表达菌株的构建及致病能力的检测
4.6 ArcZ对菌株PccS1生长能力没有影响
4.7 arcZ缺失突变株的胞外酶活性降低
4.8 arcZ缺失突变株的碳青霉烯抗生素活性降低
4.9 arcZ缺失突变株的游动性增强而生物膜产生能力下降
4.10 ArcZ影响Hcp蛋白的分泌
5 小结与讨论
第三章 软腐果胶杆菌ArcZ靶标基因的筛选与功能分析
1 引言
2 实验材料
2.1 本研究所用菌株,质粒及引物
3 试验方法
3.1 菌株培养
3.2 细菌基因组DNA提取
3.3 质粒提取
3.4 细菌RNA的提取
3.5 DNA回收
3.6 DNA片段和质粒的酶切、回收及连接反应
3.7 质粒DNA的热激转化
3.8 生物学表型测定
3.9 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
3.10 Western blot杂交检测
3.11 RNA-seq
3.12 点突变构建
4 结果与分析
4.1 ΔarcZ(T1-PBAD-arcZ),ΔarcZ(T1-PBAD)及ΔarcZ(T1-PBAD-arcZ*)菌株的构建
4.2 arcZ表达量qRT-PCR检测
4.3 阿拉伯糖诱导arcZ表达部分恢复致病能力
4.4 阿拉伯糖诱导arcZ表达恢复胞外酶至野生型水平
4.5 生物信息学预测ArcZ的靶标基因
4.6 利用RNA-seq筛选ArcZ的靶标基因
4.7 差异表达基因的qRT-PCR检测
4.8 潜在靶标基因的缺失突变体及过表达菌株的构建
4.9 潜在靶标基因的致病性测定
4.10 ArcZ促进rpoS的表达
5 小结与讨论
全文总结
本文创新点
参考文献
附录1 培养基及试剂溶液的配制
附录2 RNA-Seq差异表达基因
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
本文编号：3826802
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
上篇 文献综述
1 软腐肠杆菌概述
2 软腐果胶杆菌致病因子
2.1 胞外植物细胞壁降解酶
3 Ⅵ分泌系统
3.1 Ⅵ分泌系统的组成
4 Hfq蛋白的研究
4.1 Hfq的结构
4.2 Hfq蛋白对细菌毒力的影响
4.3 Hfq蛋白多效性作用
4.4 Hfq蛋白对Ⅲ型分泌系统的调控
4.5 Hfq对基因的全局调控作用
4.6 Hfq与靶标sNA
5 细菌sRNAs的研究
5.1 sRNA调控蛋白活性
5.2 基于碱基互补配对调控的sRNAs
6 ArcZ研究进展
6.1 ArcZ促进rpoS的翻译
6.2 ArcZ抑制flhDC的翻译
6.3 ArcZ对其他基因的调控作用
7 本文研究的目的及与意义
下篇 研究内容
第一章 软腐果胶杆菌Hfq蛋白的功能研究
1 引言
2 供试材料
2.1 本研究所用菌株、质粒和引物
3 试验方法
3.1 菌株培养
3.2 细菌基因组DNA提取
3.3 质粒的提取
3.4 细菌RNA的提取
3.5 DNA回收
3.6 DNA片段和质粒的酶切、回收及连接反应
3.7 质粒DNA的转化
3.8 缺失突变体及互补菌株的构建
3.9 生物学表型测定
3.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
3.11 转录组测序及分析
3.12 Western blot杂交检测
3.13 寄主植物胼胝质沉积的检测
4 结果与分析
4.1 目的基因的比对
4.2 hfq缺失突变株及其互补菌株的构建
4.3 hfq缺失突变株的致病能力显著下降
4.4 Hfq对菌株PccS1生长能力的影响
4.5 hfq缺失突变株的胞外酶产量降低
4.6 hfq缺失突变株的碳青霉烯抗生素活性降低
4.7 hfq缺失突变株的游动性及生物膜产生能力下降
4.8 Hfq抑制病原体相关分子诱导的寄主植物的胼胝质沉积
4.9 Hfq促进Hcp蛋白的分泌及T6SS基因簇基因的表达
4.10 Hfq对菌株PccS1基因的全局调控作用
5 小结与讨论
第二章 软腐果胶杆菌sRNAs的功能研究
1 引言
2 实验材料
2.1 本研究所用菌株、质粒和引物
3 试验方法
3.1 菌株培养
3.2 细菌基因组DNA提取
3.3 质粒提取
3.4 细菌RNA的提取
3.5 DNA回收
3.6 DNA片段和质粒的酶切、回收及连接反应
3.7 质粒DNA的热激转化
3.8 突变体及其互补菌株的构建
3.9 生物学表型测定
3.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
3.11 Western blot杂交检测
4 结果与分析
4.1 sRNAs的预测
4.2 sRNAs缺失突变体的构建
4.3 ArcZ,CsrB,SraG缺失对菌株PccS1致病能力具有显著影响
4.4 ArcZ序列比对
4.5 ArcZ互补及过表达菌株的构建及致病能力的检测
4.6 ArcZ对菌株PccS1生长能力没有影响
4.7 arcZ缺失突变株的胞外酶活性降低
4.8 arcZ缺失突变株的碳青霉烯抗生素活性降低
4.9 arcZ缺失突变株的游动性增强而生物膜产生能力下降
4.10 ArcZ影响Hcp蛋白的分泌
5 小结与讨论
第三章 软腐果胶杆菌ArcZ靶标基因的筛选与功能分析
1 引言
2 实验材料
2.1 本研究所用菌株,质粒及引物
3 试验方法
3.1 菌株培养
3.2 细菌基因组DNA提取
3.3 质粒提取
3.4 细菌RNA的提取
3.5 DNA回收
3.6 DNA片段和质粒的酶切、回收及连接反应
3.7 质粒DNA的热激转化
3.8 生物学表型测定
3.9 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
3.10 Western blot杂交检测
3.11 RNA-seq
3.12 点突变构建
4 结果与分析
4.1 ΔarcZ(T1-PBAD-arcZ),ΔarcZ(T1-PBAD)及ΔarcZ(T1-PBAD-arcZ*)菌株的构建
4.2 arcZ表达量qRT-PCR检测
4.3 阿拉伯糖诱导arcZ表达部分恢复致病能力
4.4 阿拉伯糖诱导arcZ表达恢复胞外酶至野生型水平
4.5 生物信息学预测ArcZ的靶标基因
4.6 利用RNA-seq筛选ArcZ的靶标基因
4.7 差异表达基因的qRT-PCR检测
4.8 潜在靶标基因的缺失突变体及过表达菌株的构建
4.9 潜在靶标基因的致病性测定
4.10 ArcZ促进rpoS的表达
5 小结与讨论
全文总结
本文创新点
参考文献
附录1 培养基及试剂溶液的配制
附录2 RNA-Seq差异表达基因
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
本文编号：3826802
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