热应激诱发睾丸生殖细胞损伤机制的研究
发布时间：2023-05-22 05:04
精子发生是一个复杂的生理过程,对温度具有高度的敏感性。睾丸是雄性精子发生的场所,一般情况下处在阴囊内,悬垂于体外,其温度比体温低2～4℃。但近年来由环境、病理等多种原因诱发的睾丸热应激成为雄性生殖疾病和不育的一个重要因素。据统计,睾丸温度每升高1℃,精子发生效率降低约14%。热应激的累积,还可导致睾丸萎缩、精子发生受阻、精子密度下降甚至不育等严重后果。睾丸单次热应激或隐睾会引起生精上皮的损伤和生殖细胞的消亡,但其具体的损伤过程及机制尚不完全清楚,不利于生产中应对热应激诱发的雄性生殖细胞损伤的预防和治疗。本研究以小鼠39/42℃水浴20 min睾丸单次热应激为模型,探究热应激引起的生精上皮损伤的病理学进程,进一步研究热应激后生殖细胞损伤的机制,同时评估褪黑素对热应激诱发的生殖细胞损伤的预防和治疗效果。并以手术型隐睾模型为基础,利用组织形态学鉴定、免疫组化及单细胞转录组测序和生物信息学分析等方法,探究隐睾症抑制精原细胞分化,导致精子发生阻滞的分子机制。本研究的主要研究结果如下:1.单次39℃热应激虽未引起睾丸内的明显损伤,但亚细胞结构和分子生物学检测发现该处理可以诱发生殖细胞内的自噬;而当...
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
文献综述
第一章 热应激诱发睾丸损伤的研究进展
1.1 精子发生与睾丸温度调控
1.1.1 精子发生过程
1.1.2 精子发生过程中的自然清除
1.1.3 睾丸的温度调节
1.2 热应激对精子发生的影响
1.2.1 热应激对睾丸生殖细胞的影响
1.2.2 热应激对附睾精子的影响
1.2.3 热应激对睾丸体细胞的影响
1.3 睾丸热应激的主要来源
1.3.1 生活方式和行为因素
1.3.2 职业与环境因素
1.3.3 病理性临床因素
1.4 热应激诱发睾丸生殖细胞损伤的机制
1.4.1 凋亡途径
1.4.2 自噬途径
1.4.3 DNA损伤途径
1.4.4 氧化应激途径
1.4.5 内质网应激途径
1.5 本研究的目的与意义
试验部分
第二章 单次热应激诱发生殖细胞损伤的剂量效应
2.1 材料和方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器及耗材
2.2 试验步骤
2.2.1 小鼠阴囊单次热应激
2.2.2 小鼠睾丸石蜡包埋
2.2.3 组织切片苏木精-伊红(H&E)染色
2.2.4 小鼠睾丸组织蛋白提取
2.2.5 透射电镜包埋及制片
2.2.6 组织切片免疫荧光染色
2.2.7 脂质氧化(MDA)检测
2.2.8 过氧化氢(H2O2)含量检测
2.2.9 过氧化氢酶(CAT)活性检测
2.2.10 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测
2.2.11 蛋白免疫印记(Western Blot)
2.2.12 组织切片TUNEL检测
2.2.13 统计分析
2.3 试验结果
2.3.1 单次热应激对睾丸形态学变化的影响
2.3.2 单次热应激后睾丸内氧化应激指标的影响
2.3.3 单次热应激后睾丸凋亡及自噬相关蛋白的Western Blot检测
2.3.4 单次热应激后透射电镜观察小鼠睾丸生殖细胞亚细胞结构变化
2.3.5 免疫荧光验证热应激后睾丸内的自噬与凋亡表型。
2.3.6 单次热应激后睾丸内HSPA2蛋白的变化特点
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 褪黑素对睾丸热应激损伤的预防作用
3.1 材料和方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器及耗材
3.2 实验步骤
3.2.1 动物处理
3.2.2 小鼠睾丸组织包埋
3.2.3 睾丸组织H&E染色
3.2.4 免疫组化染色
3.2.5 TUNEL染色
3.2.6 Western Blot
3.2.7 氧化应激指标检测
3.2.8 统计分析
3.3 试验结果
3.3.1 褪黑素预防42℃热应激引发的生精上皮损伤的表型检查
3.3.2 HSPA2和TUNEL检测褪黑素对睾丸42℃热应激的凋亡抑制作用
3.3.3 褪黑素预处理在睾丸42℃热应激中的抗氧化应激作用
3.3.4 MAPK应激通路在褪黑素预防睾丸热应激损伤中的作用
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 褪黑素对睾丸热应激损伤的治疗作用
4.1 材料和方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器及耗材
4.2 实验步骤
4.2.1 动物处理
4.2.2 小鼠睾丸组织包埋
4.2.3 睾丸组织H&E染色
4.3.4 睾丸生理指标的计算
4.2.5 免疫组化染色
4.2.6 统计分析
4.3 试验结果
4.3.1 褪黑素对睾丸42℃热应激损伤的治疗效果评估
4.3.2 褪黑素对睾丸热应激后支持细胞间紧密连接结构的保护作用
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 隐睾诱发睾丸生殖细胞损伤的机制
5.1 材料和方法
5.1.1 主要试剂
5.1.2 主要仪器及耗材
5.2 试验步骤
5.2.1 手术型隐睾小鼠模型的建立
5.2.2 睾丸组织包埋及切片染色及免疫组化
5.2.3 睾丸细胞的分离
5.2.4 睾丸单细胞转录组测序
5.2.5 单细胞转录组测序数据分析
5.3 结果
5.3.1 隐睾引起精子发生受阻
5.3.2 隐睾抑制精原细胞分化
5.3.3 睾丸单细胞转录组测序细胞群分析
5.3.4 隐睾导致睾丸内细胞类群比例变化
5.3.5 隐睾诱发分化精原细胞基因表达模式发生变化
5.3.6 隐睾引起精原细胞分化阻滞
5.4 讨论
5.5 小结
结论
创新点
后续研究工作
参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3822057
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
文献综述
第一章 热应激诱发睾丸损伤的研究进展
1.1 精子发生与睾丸温度调控
1.1.1 精子发生过程
1.1.2 精子发生过程中的自然清除
1.1.3 睾丸的温度调节
1.2 热应激对精子发生的影响
1.2.1 热应激对睾丸生殖细胞的影响
1.2.2 热应激对附睾精子的影响
1.2.3 热应激对睾丸体细胞的影响
1.3 睾丸热应激的主要来源
1.3.1 生活方式和行为因素
1.3.2 职业与环境因素
1.3.3 病理性临床因素
1.4 热应激诱发睾丸生殖细胞损伤的机制
1.4.1 凋亡途径
1.4.2 自噬途径
1.4.3 DNA损伤途径
1.4.4 氧化应激途径
1.4.5 内质网应激途径
1.5 本研究的目的与意义
试验部分
第二章 单次热应激诱发生殖细胞损伤的剂量效应
2.1 材料和方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器及耗材
2.2 试验步骤
2.2.1 小鼠阴囊单次热应激
2.2.2 小鼠睾丸石蜡包埋
2.2.3 组织切片苏木精-伊红(H&E)染色
2.2.4 小鼠睾丸组织蛋白提取
2.2.5 透射电镜包埋及制片
2.2.6 组织切片免疫荧光染色
2.2.7 脂质氧化(MDA)检测
2.2.8 过氧化氢(H2O2)含量检测
2.2.9 过氧化氢酶(CAT)活性检测
2.2.10 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测
2.2.11 蛋白免疫印记(Western Blot)
2.2.12 组织切片TUNEL检测
2.2.13 统计分析
2.3 试验结果
2.3.1 单次热应激对睾丸形态学变化的影响
2.3.2 单次热应激后睾丸内氧化应激指标的影响
2.3.3 单次热应激后睾丸凋亡及自噬相关蛋白的Western Blot检测
2.3.4 单次热应激后透射电镜观察小鼠睾丸生殖细胞亚细胞结构变化
2.3.5 免疫荧光验证热应激后睾丸内的自噬与凋亡表型。
2.3.6 单次热应激后睾丸内HSPA2蛋白的变化特点
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 褪黑素对睾丸热应激损伤的预防作用
3.1 材料和方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器及耗材
3.2 实验步骤
3.2.1 动物处理
3.2.2 小鼠睾丸组织包埋
3.2.3 睾丸组织H&E染色
3.2.4 免疫组化染色
3.2.5 TUNEL染色
3.2.6 Western Blot
3.2.7 氧化应激指标检测
3.2.8 统计分析
3.3 试验结果
3.3.1 褪黑素预防42℃热应激引发的生精上皮损伤的表型检查
3.3.2 HSPA2和TUNEL检测褪黑素对睾丸42℃热应激的凋亡抑制作用
3.3.3 褪黑素预处理在睾丸42℃热应激中的抗氧化应激作用
3.3.4 MAPK应激通路在褪黑素预防睾丸热应激损伤中的作用
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 褪黑素对睾丸热应激损伤的治疗作用
4.1 材料和方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器及耗材
4.2 实验步骤
4.2.1 动物处理
4.2.2 小鼠睾丸组织包埋
4.2.3 睾丸组织H&E染色
4.3.4 睾丸生理指标的计算
4.2.5 免疫组化染色
4.2.6 统计分析
4.3 试验结果
4.3.1 褪黑素对睾丸42℃热应激损伤的治疗效果评估
4.3.2 褪黑素对睾丸热应激后支持细胞间紧密连接结构的保护作用
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 隐睾诱发睾丸生殖细胞损伤的机制
5.1 材料和方法
5.1.1 主要试剂
5.1.2 主要仪器及耗材
5.2 试验步骤
5.2.1 手术型隐睾小鼠模型的建立
5.2.2 睾丸组织包埋及切片染色及免疫组化
5.2.3 睾丸细胞的分离
5.2.4 睾丸单细胞转录组测序
5.2.5 单细胞转录组测序数据分析
5.3 结果
5.3.1 隐睾引起精子发生受阻
5.3.2 隐睾抑制精原细胞分化
5.3.3 睾丸单细胞转录组测序细胞群分析
5.3.4 隐睾导致睾丸内细胞类群比例变化
5.3.5 隐睾诱发分化精原细胞基因表达模式发生变化
5.3.6 隐睾引起精原细胞分化阻滞
5.4 讨论
5.5 小结
结论
创新点
后续研究工作
参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3822057
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