磷脂酶C、E75在绿盲蝽蜕皮激素信号传导中的功能分析
发布时间：2023-05-13 01:34
绿盲蝽寄主范围广泛,可以危害林木、果树和多种经济作物。昆虫蜕皮激素(20E)信号传导通路的研究现已成为昆虫学研究的热点,磷脂酶C(Phospholipases C,PLC)参与调节多种激素和神经递质信号的转导,但其基因特征及在绿盲蝽(Apolygus lucorum)20E信号传导中的功能尚不清晰。E75是20E信号通路重要的下游应答基因,该基因的生物学特性及其在20E调控绿盲蝽繁殖中的功能尚不明确。因此,本论文采用iTRAQ分析、RACE、RNAi等研究手段,分析绿盲蝽20E信号通路中的PLC、E75的生化特征,并对其在20E信号传导中的功能进行了研究。主要研究结果如下:1.为在蛋白质组学层面阐明PLC可介导20E信号通路的传递,采用iTRAQ法对四种不同处理(20E、20E+U73122、U73122和丙酮)的绿盲蝽中肠温育样本进行了分析,明确了PLC参与了20E信号传导。发现20E处理与丙酮相比有差异表达的蛋白达100种,其中19种蛋白表达上调,81种蛋白表达下调;磷脂酶抑制剂U73122处理与丙酮处理相比,差异蛋白有261种,其中42种蛋白上调,219种蛋白下调;20E vs丙...
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
1 概述
2 昆虫蜕皮激素传导的基因组途径
3 蜕皮激素的核受体及其功能
4 昆虫蜕皮激素传导的非基因组途径
5 PLC生物学特性及功能
6 蜕皮激素级联反应
6.1 20E诱导的转录因子 75
6.2 20E 诱导的转录因子 74
6.3 变态起始因子
7 同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ)
8 研究目的意义和研究内容
8.1 研究意义
8.2 研究内容
第二章 基于i TRAQ分析绿盲蝽磷脂酶C基因Al PLC在蜕皮激素传导中的功能
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 样品准备
2.3 蛋白质提取和消化
2.4 iTRAQ标签
2.5 高pH Reversce反相分配色谱法分离
2.6 LC-ESI-MS/质谱分析
2.7 iTRAQ蛋白质鉴定和定量
2.8 生物信息学分析
3 结果与分析
3.1 20 E处理绿盲蝽后不同差异蛋白表达分析
3.2 磷酯酶C抑制剂处理后绿盲蝽后不同差异蛋白表达的分析
3.3 20 E和 U73122 处理绿盲蝽后共同差异蛋白表达分析
3.4 20 E、U73122和20E+U73122 处理绿盲蝽后差异蛋白表达分析
4 结论与讨论
第三章 绿盲蝽磷脂酶C基因Al PLCγ的克隆、表达、酶学性质及单克隆抗体的制备
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 绿盲蝽总RNA的分离及cDNA第一链的合成
2.3 Al PLCγ基因5’端序列的克隆
2.4 Al PLCγ基因3’端序列的克隆
2.5 Al PLCγ基因全长的拼接
2.6 不同日龄绿盲蝽总RNA的提取及cDNA的合成
2.7 实时荧光定量PCR
2.8 Northern Blot分析
2.9 表达载体的构建
2.10 融合蛋白的原核诱导表达
2.11 融合蛋白的变复性
2.12 融合蛋白的Ni柱亲和纯化
2.13 重组AlPLCγ蛋白的酶学特性
2.14 AlPLCγ单克隆抗体的制备
2.14.1 免疫
2.14.2 建立杂交瘤细胞株
2.14.3 制备腹水
2.14.4 抗体的纯化
2.14.5 Western-blot检测单克隆抗体的特异性
2.15 数据分析
3 结果与分析
3.1 绿盲蝽AlPLCγ基因的克隆及序列分析
3.2 绿盲蝽AlPLCγ基因的系统发育分析
3.3 绿盲蝽AlPLCγ基因表达特性分析
3.4 重组AlPLCγ的表达、复性及纯化
3.5 重组蛋白AlPLCγ磷脂酶活力的检测
3.6 不同温度下重组蛋白AlPLCγ的酶活测定
3.7 不同pH下重组AlPLCγ蛋白的酶活测定
3.8 AlPLCγ单克隆抗体的制备与特异性检测
4 结论与讨论
第四章 绿盲蝽AlPLCγ对20E下游应答基因表达的影响
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 样品处理
2.3 AlPLCγ酶活、mRNA表达量及蛋白含量
2.4 第二信使IP3 分析
2.5 第二信使DAG含量
2.6 绿盲蝽蜕皮激素响应基因mRNA表达量的分析
2.7 数据分析
3 结果与分析
3.1 不同处理对绿盲蝽AlPLCγ酶活性、基因mRNA表达量的影响
3.2 不同处理对绿盲蝽AlPLCγ蛋白含量的影响
3.3 不同处理对第二信使IP3和DAG含量的影响
3.4 不同处理对20E下游应答基因mRNA表达量的影响
4 结论与讨论
第五章 蜕皮激素受体E75在绿盲蝽繁殖中的功能
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 Al E75A基因克隆
2.3 体外翻译
2.4 Al E75A基因mRNA表达谱
2.5 Northern Blot分析
2.6 siRNA注射
2.7 RNAi效果检测
2.8 Western blot分析
2.9 Al Vg表达谱分析
2.10 20 E处理
2.11 统计分析
3 结果与分析
3.1 绿盲蝽Al E75A基因全长序列特征
3.2 AlE75A表达谱分析
3.3 体内敲除AlE75A基因对繁殖力的影响
3.4 20 E对绿盲蝽AlVg基因表达量的影响
3.5 AlE75A RNAi对 AlVg基因表达的影响
3.6 AlE75A RNAi对AlVg蛋白水平的影响
4 结论与讨论
第六章 绿盲蝽蜕皮激素响应基因E75D的克隆及表达特性
1 前言
2 材料和方法
2.1 供试昆虫
2.2 绿盲蝽Al E75D全长基因的克隆
2.3 荧光定量PCR反应
2.4 AlE75D基因在大肠杆菌Arctic Express中的表达
2.5 重组AlE75D蛋白的纯化
2.6 单克隆抗体的制备
2.6.1 免疫
2.6.2 建立杂交瘤细胞株
2.6.3 制备腹水
2.7 单克隆抗体的鉴定
2.7.1 抗体的纯化
2.7.2 Western-blot检测单克隆抗体的特异性
2.8 数据分析
3 结果与分析
3.1 AlE75D的克隆与序列分析
3.2 AlE75D基因的表达特性
3.3 AlE75D的原核表达
3.4 重组蛋白的Ni柱亲和纯化
3.5 抗AlE75D蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
3.6 AlE75D蛋白单克隆抗体的特异性鉴定
4 结论与讨论
第七章 全文总结
1 主要研究结果
1.1 iTRAQ法明确了PLC可参与绿盲蝽蜕皮激素信号的传导
1.2 明确了绿盲蝽Al PLCγ的生化特征
1.3 阐明了Al PLCγ在20E及U73122诱导下的应答反应
1.4 明确了绿盲蝽E75在20E调控绿盲蝽繁殖中的功能
2 主要创新点
3 不足与展望
攻读学位期间发表的学术论文
附表
参考文献
本文编号：3815031
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
1 概述
2 昆虫蜕皮激素传导的基因组途径
3 蜕皮激素的核受体及其功能
4 昆虫蜕皮激素传导的非基因组途径
5 PLC生物学特性及功能
6 蜕皮激素级联反应
6.1 20E诱导的转录因子 75
6.2 20E 诱导的转录因子 74
6.3 变态起始因子
7 同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ)
8 研究目的意义和研究内容
8.1 研究意义
8.2 研究内容
第二章 基于i TRAQ分析绿盲蝽磷脂酶C基因Al PLC在蜕皮激素传导中的功能
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 样品准备
2.3 蛋白质提取和消化
2.4 iTRAQ标签
2.5 高pH Reversce反相分配色谱法分离
2.6 LC-ESI-MS/质谱分析
2.7 iTRAQ蛋白质鉴定和定量
2.8 生物信息学分析
3 结果与分析
3.1 20 E处理绿盲蝽后不同差异蛋白表达分析
3.2 磷酯酶C抑制剂处理后绿盲蝽后不同差异蛋白表达的分析
3.3 20 E和 U73122 处理绿盲蝽后共同差异蛋白表达分析
3.4 20 E、U73122和20E+U73122 处理绿盲蝽后差异蛋白表达分析
4 结论与讨论
第三章 绿盲蝽磷脂酶C基因Al PLCγ的克隆、表达、酶学性质及单克隆抗体的制备
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 绿盲蝽总RNA的分离及cDNA第一链的合成
2.3 Al PLCγ基因5’端序列的克隆
2.4 Al PLCγ基因3’端序列的克隆
2.5 Al PLCγ基因全长的拼接
2.6 不同日龄绿盲蝽总RNA的提取及cDNA的合成
2.7 实时荧光定量PCR
2.8 Northern Blot分析
2.9 表达载体的构建
2.10 融合蛋白的原核诱导表达
2.11 融合蛋白的变复性
2.12 融合蛋白的Ni柱亲和纯化
2.13 重组AlPLCγ蛋白的酶学特性
2.14 AlPLCγ单克隆抗体的制备
2.14.1 免疫
2.14.2 建立杂交瘤细胞株
2.14.3 制备腹水
2.14.4 抗体的纯化
2.14.5 Western-blot检测单克隆抗体的特异性
2.15 数据分析
3 结果与分析
3.1 绿盲蝽AlPLCγ基因的克隆及序列分析
3.2 绿盲蝽AlPLCγ基因的系统发育分析
3.3 绿盲蝽AlPLCγ基因表达特性分析
3.4 重组AlPLCγ的表达、复性及纯化
3.5 重组蛋白AlPLCγ磷脂酶活力的检测
3.6 不同温度下重组蛋白AlPLCγ的酶活测定
3.7 不同pH下重组AlPLCγ蛋白的酶活测定
3.8 AlPLCγ单克隆抗体的制备与特异性检测
4 结论与讨论
第四章 绿盲蝽AlPLCγ对20E下游应答基因表达的影响
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 样品处理
2.3 AlPLCγ酶活、mRNA表达量及蛋白含量
2.4 第二信使IP3 分析
2.5 第二信使DAG含量
2.6 绿盲蝽蜕皮激素响应基因mRNA表达量的分析
2.7 数据分析
3 结果与分析
3.1 不同处理对绿盲蝽AlPLCγ酶活性、基因mRNA表达量的影响
3.2 不同处理对绿盲蝽AlPLCγ蛋白含量的影响
3.3 不同处理对第二信使IP3和DAG含量的影响
3.4 不同处理对20E下游应答基因mRNA表达量的影响
4 结论与讨论
第五章 蜕皮激素受体E75在绿盲蝽繁殖中的功能
1 前言
2 材料与方法
2.1 供试昆虫
2.2 Al E75A基因克隆
2.3 体外翻译
2.4 Al E75A基因mRNA表达谱
2.5 Northern Blot分析
2.6 siRNA注射
2.7 RNAi效果检测
2.8 Western blot分析
2.9 Al Vg表达谱分析
2.10 20 E处理
2.11 统计分析
3 结果与分析
3.1 绿盲蝽Al E75A基因全长序列特征
3.2 AlE75A表达谱分析
3.3 体内敲除AlE75A基因对繁殖力的影响
3.4 20 E对绿盲蝽AlVg基因表达量的影响
3.5 AlE75A RNAi对 AlVg基因表达的影响
3.6 AlE75A RNAi对AlVg蛋白水平的影响
4 结论与讨论
第六章 绿盲蝽蜕皮激素响应基因E75D的克隆及表达特性
1 前言
2 材料和方法
2.1 供试昆虫
2.2 绿盲蝽Al E75D全长基因的克隆
2.3 荧光定量PCR反应
2.4 AlE75D基因在大肠杆菌Arctic Express中的表达
2.5 重组AlE75D蛋白的纯化
2.6 单克隆抗体的制备
2.6.1 免疫
2.6.2 建立杂交瘤细胞株
2.6.3 制备腹水
2.7 单克隆抗体的鉴定
2.7.1 抗体的纯化
2.7.2 Western-blot检测单克隆抗体的特异性
2.8 数据分析
3 结果与分析
3.1 AlE75D的克隆与序列分析
3.2 AlE75D基因的表达特性
3.3 AlE75D的原核表达
3.4 重组蛋白的Ni柱亲和纯化
3.5 抗AlE75D蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
3.6 AlE75D蛋白单克隆抗体的特异性鉴定
4 结论与讨论
第七章 全文总结
1 主要研究结果
1.1 iTRAQ法明确了PLC可参与绿盲蝽蜕皮激素信号的传导
1.2 明确了绿盲蝽Al PLCγ的生化特征
1.3 阐明了Al PLCγ在20E及U73122诱导下的应答反应
1.4 明确了绿盲蝽E75在20E调控绿盲蝽繁殖中的功能
2 主要创新点
3 不足与展望
攻读学位期间发表的学术论文
附表
参考文献
本文编号：3815031
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3815031.html