猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析
发布时间：2022-10-04 19:54
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原是PRRS病毒（PRRSV）,是一种危害严重的病毒性疫病,给全球养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV非结构蛋白9（Non-structural protein 9,Nsp9）有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）功能,对病毒复制至关重要。另外,Nsp9序列相对保守,是理想的抗PRRSV靶标。实验室前期研究发现在MARC-145细胞中稳定表达Nsp9特异性纳米抗体Nb6能抑制PRRSV复制。同时,还证明了Nb6与细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide,CPP）融合表达的重组蛋白能进入宿主细胞并发挥抗病毒功能。然而,Nb6通过靶向Nsp9抑制PRRSV复制的抗病毒机制尚不清楚,此外,Nsp9的三维结构未知。本研究使用X-射线小角散射（Small-angle X-ray scattering,SAXS）技术,获得了Nsp9以及Nsp9-Nb6复合物的分子包膜信息,同时鉴定了参与Nsp9-Nb6相互作用的重要氨基酸位点。在此基础上,本研究进一步通过反向遗传技术构建了突变这些氨基...
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展
1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概况
1.1.2 PRRSV基因组构成
1.1.3 PRRSV感染有关的细胞的受体及因子
1.1.4 PRRSV致病的分子机制
1.2 PRRSV Nsp9概述
1.3 PRRSV防控策略
1.3.1 PRRSV入侵阻断剂
1.3.2 PRRSV感染过程中宿主miRNAs的抗病毒作用
1.3.3 基于反义RNA的策略作为PRRSV特异性疗法
1.3.4 草药提取物和化合物抑制PRRSV
1.3.5 抗PRRSV的纳米抗体
1.3.6 免疫刺激剂及其作为PRRSV疫苗佐剂的潜力
1.3.7 当前的挑战和未来的研究方向
1.4 X-射线小角散射概述
1.4.1 SAXS在结构分析中的应用
1.4.2 展望
1.5 本研究的目的和意义
第二章 PRRSV Nsp9的生物学结构研究
2.1 材料
2.1.1 质粒
2.1.2 主要试剂和耗材
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂配制
2.2 方法
2.2.1 Nsp9重组蛋白的表达纯化
2.2.2 Nsp9重组蛋白的晶体生长
2.2.3 Nsp9重组蛋白结构预测
2.2.4 Nsp9截短片段的扩增以及原核表达载体的构建
2.2.5 分析Nsp9截短蛋白在大肠杆菌中的表达
2.2.6 测量Nsp9重组蛋白的粒径大小
2.2.7 Nsp9 重组蛋白SAXS分析
2.3 结果
2.3.1 Nsp9重组蛋白的纯化
2.3.2 Nsp9重组蛋白预测的结构
2.3.3 Nsp9截短片段原核表达载体的构建以及表达
2.3.4 Nsp9重组蛋白DLS分析
2.3.5 Nsp9SAXS分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 Nsp9 特异的纳米抗体Nb6和Nb7的生物学结构研究
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂和耗材
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要试剂配制
3.2 方法
3.2.1 基因扩增及表达载体的构建
3.2.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
3.2.3 Nb6/Nb7重组蛋白在巴斯德毕氏酵母X-33中的克隆、表达和纯化
3.2.4 在酵母中表达的Nb6/Nb7重组蛋白的晶体生长
3.2.5 Nb7重组蛋白晶体数据收集与处理
3.2.6 解析Nb7重组蛋白的晶体结构
3.3 结果
3.3.1 pMECS-Nb6/Nb7原核表达载体的构建
3.3.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中周质中的表达及纯化
3.3.3 pPICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体的构建
3.3.4 Nb6/Nb7重组蛋白在酵母中的表达分析
3.3.5 Nb6/Nb7重组蛋白的纯化
3.3.6 Nb6/Nb7重组蛋白结晶及条件优化
3.3.7 Nb7重组蛋白的晶体数据收集、处理及结构解析
3.3.8 Nb7重组蛋白晶体结构
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 Nsp9 上影响PRRSV复制关键氨基酸位点分析
4.1 材料
4.1.1 主要试剂耗材
4.1.2 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 BLI分析Nsp9重组蛋白与Nb6之间的亲和力大小
4.2.2 Nsp9-Nb6复合物的纯化
4.2.3 测量Nsp9-Nb6复合物的粒径大小
4.2.4 Nsp9-Nb6复合物蛋白晶体生长条件筛选
4.2.5 Nsp9-Nb6 复合物SAXS分析
4.2.6 Nb6突变体蛋白的表达和纯化
4.2.7 Nsp9突变体蛋白的表达和纯化
4.2.8 Nb6突变体蛋白与Nsp9之间的亲和力测定
4.2.9 Nsp9突变体蛋白与Nb6之间的亲和力测定
4.2.10 突变病毒的构建及鉴定
4.2.11 突变病毒的拯救
4.2.12 拯救病毒的鉴定
4.2.13 重组病毒的病毒滴度测定
4.2.14 重组病毒的增殖特性分析
4.2.15 Nsp9上的氨基酸替换对病毒RNA相对水平的影响
4.2.16 Nsp9上的氨基酸替换对病毒负链基因组RNA水平的影响
4.2.17 Nsp9上的氨基酸替换对病毒感染水平的影响
4.2.18 对PRRSV Nsp9中氨基酸残基561-689进行序列比对
4.3 结果
4.3.1 Nb6和Nsp9之间亲和力的测定
4.3.2 Nb6与Nsp9复合物的纯化
4.3.3 DLS检测分析
4.3.4 Nsp9-Nb6复合物SAXS分析
4.3.5 Nsp9-Nb6复合物相互作用位点分析
4.3.6 突变质粒的构建
4.3.7 突变病毒的拯救
4.3.8 拯救病毒的核酸检测
4.3.9 Nsp9上参与病毒复制的关键氨基酸位点鉴定
4.3.10 病毒感染能力检测
4.3.11 I588、L643在Nsp9的保守性分析
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 全文总结
参考文献
附录
致谢
个人简历
本文编号：3685660
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展
1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概况
1.1.2 PRRSV基因组构成
1.1.3 PRRSV感染有关的细胞的受体及因子
1.1.4 PRRSV致病的分子机制
1.2 PRRSV Nsp9概述
1.3 PRRSV防控策略
1.3.1 PRRSV入侵阻断剂
1.3.2 PRRSV感染过程中宿主miRNAs的抗病毒作用
1.3.3 基于反义RNA的策略作为PRRSV特异性疗法
1.3.4 草药提取物和化合物抑制PRRSV
1.3.5 抗PRRSV的纳米抗体
1.3.6 免疫刺激剂及其作为PRRSV疫苗佐剂的潜力
1.3.7 当前的挑战和未来的研究方向
1.4 X-射线小角散射概述
1.4.1 SAXS在结构分析中的应用
1.4.2 展望
1.5 本研究的目的和意义
第二章 PRRSV Nsp9的生物学结构研究
2.1 材料
2.1.1 质粒
2.1.2 主要试剂和耗材
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂配制
2.2 方法
2.2.1 Nsp9重组蛋白的表达纯化
2.2.2 Nsp9重组蛋白的晶体生长
2.2.3 Nsp9重组蛋白结构预测
2.2.4 Nsp9截短片段的扩增以及原核表达载体的构建
2.2.5 分析Nsp9截短蛋白在大肠杆菌中的表达
2.2.6 测量Nsp9重组蛋白的粒径大小
2.2.7 Nsp9 重组蛋白SAXS分析
2.3 结果
2.3.1 Nsp9重组蛋白的纯化
2.3.2 Nsp9重组蛋白预测的结构
2.3.3 Nsp9截短片段原核表达载体的构建以及表达
2.3.4 Nsp9重组蛋白DLS分析
2.3.5 Nsp9SAXS分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 Nsp9 特异的纳米抗体Nb6和Nb7的生物学结构研究
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂和耗材
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要试剂配制
3.2 方法
3.2.1 基因扩增及表达载体的构建
3.2.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
3.2.3 Nb6/Nb7重组蛋白在巴斯德毕氏酵母X-33中的克隆、表达和纯化
3.2.4 在酵母中表达的Nb6/Nb7重组蛋白的晶体生长
3.2.5 Nb7重组蛋白晶体数据收集与处理
3.2.6 解析Nb7重组蛋白的晶体结构
3.3 结果
3.3.1 pMECS-Nb6/Nb7原核表达载体的构建
3.3.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中周质中的表达及纯化
3.3.3 pPICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体的构建
3.3.4 Nb6/Nb7重组蛋白在酵母中的表达分析
3.3.5 Nb6/Nb7重组蛋白的纯化
3.3.6 Nb6/Nb7重组蛋白结晶及条件优化
3.3.7 Nb7重组蛋白的晶体数据收集、处理及结构解析
3.3.8 Nb7重组蛋白晶体结构
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 Nsp9 上影响PRRSV复制关键氨基酸位点分析
4.1 材料
4.1.1 主要试剂耗材
4.1.2 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 BLI分析Nsp9重组蛋白与Nb6之间的亲和力大小
4.2.2 Nsp9-Nb6复合物的纯化
4.2.3 测量Nsp9-Nb6复合物的粒径大小
4.2.4 Nsp9-Nb6复合物蛋白晶体生长条件筛选
4.2.5 Nsp9-Nb6 复合物SAXS分析
4.2.6 Nb6突变体蛋白的表达和纯化
4.2.7 Nsp9突变体蛋白的表达和纯化
4.2.8 Nb6突变体蛋白与Nsp9之间的亲和力测定
4.2.9 Nsp9突变体蛋白与Nb6之间的亲和力测定
4.2.10 突变病毒的构建及鉴定
4.2.11 突变病毒的拯救
4.2.12 拯救病毒的鉴定
4.2.13 重组病毒的病毒滴度测定
4.2.14 重组病毒的增殖特性分析
4.2.15 Nsp9上的氨基酸替换对病毒RNA相对水平的影响
4.2.16 Nsp9上的氨基酸替换对病毒负链基因组RNA水平的影响
4.2.17 Nsp9上的氨基酸替换对病毒感染水平的影响
4.2.18 对PRRSV Nsp9中氨基酸残基561-689进行序列比对
4.3 结果
4.3.1 Nb6和Nsp9之间亲和力的测定
4.3.2 Nb6与Nsp9复合物的纯化
4.3.3 DLS检测分析
4.3.4 Nsp9-Nb6复合物SAXS分析
4.3.5 Nsp9-Nb6复合物相互作用位点分析
4.3.6 突变质粒的构建
4.3.7 突变病毒的拯救
4.3.8 拯救病毒的核酸检测
4.3.9 Nsp9上参与病毒复制的关键氨基酸位点鉴定
4.3.10 病毒感染能力检测
4.3.11 I588、L643在Nsp9的保守性分析
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 全文总结
参考文献
附录
致谢
个人简历
本文编号：3685660
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3685660.html