小鼠卵原干细胞分离建系及其体外分化形成功能性卵母细胞的研究
发布时间：2023-05-25 06:07
本论文首先利用差速贴壁法分别从出生7天后(7 days post parturition,7dpp)的新生小鼠以及4周龄(4 Weeks,4W)的青春期小鼠卵巢中分离、富集OSCs,分别命名为7dpp-putative OSCs以及4W-putative OSCs,经过体外培养传代、细胞形态观察、碱性磷酸酶染色、RT-PCR标志基因表达水平检测、细胞免疫荧光染色、体内卵巢移植实验以及转录组测序(RNA-seq)等技术手段,鉴定、分析从不同周龄小鼠卵巢中分离获得的细胞生物学特性。实验结果表明在体外培养过程中两种细胞在形态上具有很大差异,7dpp-putative OSCs形成串状克隆,细胞连接紧密,经过传代培养后细胞增殖聚集成簇;4W-putative OSCs部分细胞聚集形成较为立体的克隆,经过传代培养后克隆逐渐变为扁平上皮状。在基因表达水平上,7dpp-putative OSCs表达Oct4、Blimp1、Ddx4等生殖干细胞标志基因及蛋白,而4W-putative OSCs不表达Blimp1基因,同时Oct4、Ddx4表达水平较低,但Ifitm3、Cdh1表达水平较高。RNA-se...
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 引言
1.1 干细胞的定义
1.1.1 胚胎早期发育与干细胞来源
1.1.2 干细胞的分类与定义
1.2 生殖干细胞
1.2.1 生殖干细胞的定义
1.2.2 精原干细胞的定义
1.2.3 精原细胞的分类
1.2.4 精原干细胞的增殖调控
1.3 卵原干细胞
1.3.1 卵原干细胞及其研究进展
1.3.2 卵原干细胞的特征
1.3.3 卵原干细胞的增殖调控
1.3.4 卵原干细胞体外分化形成卵母细胞的研究
1.3.5 卵泡发育
1.3.6 卵原干细胞的研究意义
第二章 OSCs体外分离建系及其生物学特性的研究
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 实验所用主要试剂的配置
2.2 实验方法
2.2.1 饲养层细胞的准备
2.2.2 OSCs的分离、纯化、培养
2.2.4 OSCs的标志基因蛋白以及碱性磷酸酶鉴定
2.2.5 OSCs体内分化形成卵子潜能的鉴定
2.2.6 OSCs转录组测序分析
2.3 实验结果
2.3.1 OSCs体外培养细胞形态
2.3.2 NBT/BCIP染色鉴定OSCs碱性磷酸酶表达结果
2.3.3 RT-PCR检测OSCs标志基因的表达
2.3.4 免疫荧光染色检测OSCs标志蛋白表达
2.3.5 OSCs体内卵巢移植结果
2.3.6 OSCs转录组测序分析结果
2.4 讨论
第三章 OSCs体外分化形成功能性卵母细胞的研究
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
3.1.2 实验所用主要溶液试剂的配置
3.2 实验方法
3.2.1 OSCs与新生小鼠卵巢体细胞聚合形成聚合细胞团
3.2.2 OSCs与卵巢体细胞形成聚合细胞团的体内肾包膜下移植
3.2.3 OSCs与卵巢体细胞形成聚合细胞团肾包膜下移植后雌激素的测定
3.2.4 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植后卵巢再生的检测
3.2.5 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团在体外培养形成重组卵巢
3.2.6 MII期卵母细胞孤雌激活
3.2.7 MII期卵母细胞体外单精注射
3.2.8 胚胎移植及子代鉴定
3.2.9 OSCs体外分化进入减数分裂Sycp3 染色
3.2.10 OSCs体外分化形成GV期卵子与体内正常GV期卵子的转录组测序分析
3.2.11 数据分析
3.3 实验结果
3.3.1 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植结果
3.3.2 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植雌激素分泌结果
3.3.3 OSCs与卵巢体细胞体外共培养不同阶段形成重组卵泡
3.3.4 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞形态及成熟率分析
3.3.5 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞孤雌激活后胚胎发育
3.3.6 OSCs体外分化进入减数分裂Sycp3 染色鉴定
3.3.7 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞ISCI后产生子代
3.3.8 OSCs体外分化形成GV期卵母细胞形态
3.3.9 OSCs体外分化形成GV期卵母细胞与体内正常GV期卵母细胞转录组分析
3.4 讨论
第四章 OSCs、PGCs及 ESCs基因表达分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
4.1.2 主要溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 PGCs的获得
4.2.2 ESCs细胞培养
4.2.3 OSCs细胞培养
4.2.4 q-PCR检测OSCs、PGCs和 ESCs基因表达
4.2.5 转录组测序分析OSCs、PGCs及 ESCs差异基因表达
4.2.6 数据分析
4.3 实验结果
4.3.1 q-PCR检测OSCs、PGCs和 ESCs差异基因表达
4.3.2 转录组测序分析OSCs、PGCs和 ESCs基因表达
4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表的学术论文及成果
本文编号：3823087
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 引言
1.1 干细胞的定义
1.1.1 胚胎早期发育与干细胞来源
1.1.2 干细胞的分类与定义
1.2 生殖干细胞
1.2.1 生殖干细胞的定义
1.2.2 精原干细胞的定义
1.2.3 精原细胞的分类
1.2.4 精原干细胞的增殖调控
1.3 卵原干细胞
1.3.1 卵原干细胞及其研究进展
1.3.2 卵原干细胞的特征
1.3.3 卵原干细胞的增殖调控
1.3.4 卵原干细胞体外分化形成卵母细胞的研究
1.3.5 卵泡发育
1.3.6 卵原干细胞的研究意义
第二章 OSCs体外分离建系及其生物学特性的研究
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 实验所用主要试剂的配置
2.2 实验方法
2.2.1 饲养层细胞的准备
2.2.2 OSCs的分离、纯化、培养
2.2.4 OSCs的标志基因蛋白以及碱性磷酸酶鉴定
2.2.5 OSCs体内分化形成卵子潜能的鉴定
2.2.6 OSCs转录组测序分析
2.3 实验结果
2.3.1 OSCs体外培养细胞形态
2.3.2 NBT/BCIP染色鉴定OSCs碱性磷酸酶表达结果
2.3.3 RT-PCR检测OSCs标志基因的表达
2.3.4 免疫荧光染色检测OSCs标志蛋白表达
2.3.5 OSCs体内卵巢移植结果
2.3.6 OSCs转录组测序分析结果
2.4 讨论
第三章 OSCs体外分化形成功能性卵母细胞的研究
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
3.1.2 实验所用主要溶液试剂的配置
3.2 实验方法
3.2.1 OSCs与新生小鼠卵巢体细胞聚合形成聚合细胞团
3.2.2 OSCs与卵巢体细胞形成聚合细胞团的体内肾包膜下移植
3.2.3 OSCs与卵巢体细胞形成聚合细胞团肾包膜下移植后雌激素的测定
3.2.4 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植后卵巢再生的检测
3.2.5 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团在体外培养形成重组卵巢
3.2.6 MII期卵母细胞孤雌激活
3.2.7 MII期卵母细胞体外单精注射
3.2.8 胚胎移植及子代鉴定
3.2.9 OSCs体外分化进入减数分裂Sycp3 染色
3.2.10 OSCs体外分化形成GV期卵子与体内正常GV期卵子的转录组测序分析
3.2.11 数据分析
3.3 实验结果
3.3.1 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植结果
3.3.2 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植雌激素分泌结果
3.3.3 OSCs与卵巢体细胞体外共培养不同阶段形成重组卵泡
3.3.4 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞形态及成熟率分析
3.3.5 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞孤雌激活后胚胎发育
3.3.6 OSCs体外分化进入减数分裂Sycp3 染色鉴定
3.3.7 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞ISCI后产生子代
3.3.8 OSCs体外分化形成GV期卵母细胞形态
3.3.9 OSCs体外分化形成GV期卵母细胞与体内正常GV期卵母细胞转录组分析
3.4 讨论
第四章 OSCs、PGCs及 ESCs基因表达分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
4.1.2 主要溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 PGCs的获得
4.2.2 ESCs细胞培养
4.2.3 OSCs细胞培养
4.2.4 q-PCR检测OSCs、PGCs和 ESCs基因表达
4.2.5 转录组测序分析OSCs、PGCs及 ESCs差异基因表达
4.2.6 数据分析
4.3 实验结果
4.3.1 q-PCR检测OSCs、PGCs和 ESCs差异基因表达
4.3.2 转录组测序分析OSCs、PGCs和 ESCs基因表达
4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表的学术论文及成果
本文编号：3823087
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/jckxbs/3823087.html