乳酸乳球菌upp基因缺陷互补型质粒载体系统的构建及其缺失菌生物学特性研究

发布时间：2021-11-07 10:57

　　乳酸菌是人和动物肠道内重要的益生菌群,与人类生活密切相关。乳酸菌作为一种可安全使用的食品级微生物,其应用历史长久,且被广泛地用于食品加工、工业发酵以及微生态制剂研制等多种领域,其中绝大多数种类的乳球菌和乳杆菌均可用于安全生产。乳酸菌具有提高人和动物胃肠道粘膜免疫功能的作用,可作为免疫佐剂,也是表达外源蛋白最理想的候选载体菌株。随着对乳酸菌分子生物学研究的日益深入以及其在食品、医药等行业的广泛应用,可利用现代分子生物学技术来构建和应用乳酸菌食品级高效表达载体系统,这对于乳酸菌应用潜能的开发和乳品工业的发展具有十分重要意义,也是近年来的研究热点。乳酸乳球菌能够广泛的存在于人和动物消化道中,并发挥着重要的生理作用,而且其在作为安全性良好的外源基因表达宿主菌方面也已显现出较大的发展潜力。乳酸菌整合载体主要用于染色体突变,即通过整合或基因替代进行任意特殊位点基因的改变。食品级整合载体是在染色体上进行基因重组,无选择标记、无碱基残留,且重组多发生在非编码区域。温敏型质粒在一定温度范围内可正常复制,当温度高于一定阀值时质粒复制效率降低或不复制。反选择标记基因指在特定的筛选条件下,含有反选择标记基因的... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：95 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 研究的目的和意义
    1.2 乳酸菌的益生作用及其在基因工程中的应用
        1.2.1 乳酸菌的益生性作用
        1.2.2 基因工程乳酸菌的应用
        1.2.3 基因工程乳酸乳球菌的应用
    1.3 乳酸菌食品级表达系统的研究进展
        1.3.1 食品级选择标记研究进展
        1.3.2 乳酸菌基因组整合系统的研究进展
    1.4 基因工程（转基因）乳酸菌的安全性评价
        1.4.1 基因工程（转基因）乳酸菌安全性评价的必要性
        1.4.2 细菌转录组测序的研究进展
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 载体质粒和菌株
        2.1.2 主要生物化学试剂
        2.1.3 引物合成与测序
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 乳球菌pGBWVHC32-upp载体的构建
        2.2.2 pGBWVHC32-upp载体在L. lactis MG1363中的温度敏感性试验
        2.2.3 基因打靶整合型载体的构建
        2.2.4 缺失upp基因L. lactis MG1363的构建
        2.2.5 缺失upp基因L. lactis MG1363的生物学特性分析
        2.2.6 Upp基因缺陷互补型质粒载体系统的构建
3 结果
    3.1 乳球菌pGBWVHC32-upp载体的构建结果
        3.1.1 upp基因的扩增和测序结果
        3.1.2 重组质粒pMD18-T-upp的鉴定结果
        3.1.3 pGBWVHC32-upp载体的鉴定结果
    3.2 pGBWVHC32-upp载体在乳球菌中的温度敏感性试验结果
    3.3 基因打靶整合型载体的构建结果
        3.3.1 Upp基因两侧同源臂基因扩增结果
        3.3.2 重组质粒pMD18-T-1L/2L/1R/2R的鉴定结果
        3.3.3 pGBWVHC32-upp-1L载体的鉴定结果
        3.3.4 基因打靶整合型载体pGBWVHC32-upp-1L1R的鉴定结果
        3.3.5 基因打靶整合型载体pGBWVHC32-upp-1L2R的鉴定结果
        3.3.6 pGBWVHC32-upp-2L载体的鉴定结果
        3.3.7 基因打靶整合型载体pGBWVHC32-upp-2L1R的鉴定结果
        3.3.8 基因打靶整合型载体pGBWVHC32-upp-2L2R的鉴定结果
    3.4 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株的获得
        3.4.1 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株的PCR鉴定结果
        3.4.2 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株中的质粒残留鉴定结果
        3.4.3 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株upp基因区域的测序结果
    3.5 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株的生物学特性分析结果
        3.5.1 缺失upp基因的L. lactis MG1363的遗传稳定性测试结果
        3.5.2 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株生长曲线比较结果
        3.5.3 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株碳源利用结果
        3.5.4 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株的形态学比较结果
        3.5.5 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株的转录组测序结果
    3.6 Upp基因缺陷互补型质粒载体系统的构建及CaIFN-γ 蛋白的表达
        3.6.1 Upp基因和pAMJ399-CaIFN-γ 的扩增结果
        3.6.2 重组乳球菌pAMJ399upp-CaIFN-γ/△upp L. lactis MG1363的鉴定结果
        3.6.3 重组L. lactis MG1363表达CaIFN-γ 蛋白的鉴定
4 讨论
    4.1 温敏型质粒和反选择标记在乳酸菌基因操作中的应用
    4.2 乳酸乳球菌upp缺失菌株的生物学特性
    4.3 Upp基因缺陷互补型质粒载体系统在L. lactis MG1363表达系统中的使用
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3481734