西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克

发布时间：2021-11-06 15:44

　　类胡萝卜素为以多个共轭的碳碳双键为生色系骨架的脂肪族或脂环族类型化合物,是由植物和微生物合成的一大类色素,因具有多种医学生物学功能而广受关注。西瓜（Citrullus lanatus）属于大众化水果之一,瓜瓤所具有的红、粉红、黄、白等瓤色是由类胡萝卜素组成与含量的差异所致的,研究西瓜类胡萝卜素生物合成积累代谢,并进行遗传操作,探讨其抗肿瘤作用,可为西瓜类胡萝卜素的开发利用,进行西瓜营养育种和种质创新提供依据。本课题从基因水平上分析西瓜果实类胡萝卜素合成代谢的调控机制,并建立农杆菌介导的西瓜遗传转化体系,试图通过转基因技术对西瓜果实类胡萝卜素的成分进行改良。此外,本课题还对番茄红素和β-胡萝卜素抗肿瘤作用的分子机制进行研究。主要内容如下:利用RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中分离获得牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氢番茄红素合成酶基因PSY的c DNA全长序列,并通过生物信息学方法对其核酸及推导的氨基酸序列进行分析。结果显示,（1）西瓜GGPS基因c DNA序列全长1,445 bp（Gen Bank登录号:KF914758）,开放阅读框为1,092 bp,编码363个氨基... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 类胡萝卜素概述
    1.2 植物中类胡萝卜素的功能
    1.3 植物类胡萝卜素的生物合成
        1.3.1 植物类胡萝卜素的合成途径
        1.3.2 植物类胡萝卜素的合成调控
        1.3.3 植物类胡萝卜素的基因工程
    1.4 西瓜果实类胡萝卜素的研究进展
    1.5 本课题的立题依据及研究内容
        1.5.1 立题依据
        1.5.2 研究内容
2 西瓜GGPS和PSY基因全长CDNA的克隆与序列分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 植物材料、菌株及质粒
        2.2.2 工具酶及生化试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 果实总RNA提取与cDNA合成
        2.3.2 保守序列的扩增
        2.3.3 5‘端和 3‘序列的扩增
        2.3.4 全长序列的扩增
        2.3.5 序列分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 果实总RNA的提取
        2.4.2 GGPS基因全长的克隆
        2.4.3 GGPS核酸与氨基酸序列分析
        2.4.4 PSY基因全长的克隆
        2.4.5 PSY核酸与氨基酸序列分析
    2.5 小结
3 西瓜果实发育过程中类胡萝卜素的组成与其代谢相关酶基因的表达
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 植物材料
        3.2.2 工具酶及生化试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 果实瓤色的检测
        3.3.2 果实类胡萝卜素的提取
        3.3.3 类胡萝卜素的HPLC检测
        3.3.4 果实总RNA提取与cDNA合成
        3.3.5 荧光定量PCR引物设计
        3.3.6 荧光定量PCR反应
        3.3.7 数据分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 果实发育过程中瓤色的变化
        3.4.2 果实发育过程中类胡萝卜素的组成
        3.4.3 果实发育过程中类胡萝卜素代谢相关酶基因的表达
        3.4.4 类胡萝卜素含量与其代谢相关酶基因表达量的相关性分析
    3.5 讨论
    3.6 小结
4 类胡萝卜素合成酶基因果实特异性表达载体的构建
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 植物材料、菌株及质粒
        4.2.2 工具酶及生化试剂
        4.2.3 培养基及主要试剂
        4.2.4 PCR引物
    4.3 实验方法
        4.3.1 果实基因组DNA提取
        4.3.2 果实总RNA提取与cDNA合成
        4.3.3 PCR扩增
        4.3.4 DNA酶切与连接
        4.3.5 重组表达载体转化农杆菌
    4.4 结果与分析
        4.4.1 重组载体pAGPL1 的构建
        4.4.2 重组表达载体pAGPL1-GGPS的构建
        4.4.3 重组表达载体pAGPL1-PSY的构建
        4.4.4 重组表达载体pAGPL1-LCYB的构建
        4.4.5 重组表达载体转化农杆菌
    4.5 讨论
    4.6 小结
5 农杆菌介导GGPS基因对西瓜的遗传转化
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 植物材料及菌株
        5.2.2 培养基及主要试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 西瓜子叶体外再生体系的建立
        5.3.2 农杆菌介导西瓜遗传转化体系的建立
        5.3.3 抗性苗的分子鉴定
    5.4 结果与分析
        5.4.1 西瓜子叶体外再生体系的建立
        5.4.2 农杆菌介导西瓜遗传转化体系的建立
        5.4.3 抗性苗的分子鉴定
    5.5 讨论
        5.5.1 西瓜子叶体外再生体系
        5.5.2 农杆菌介导西瓜遗传转化体系
    5.6 小结
6 番茄红素和β-胡萝卜素对癌细胞的作用及其机制
    6.1 引言
    6.2 实验材料
        6.2.1 细胞材料
        6.2.2 抗体及生化试剂
        6.2.3 培养基及主要试剂
    6.3 实验方法
        6.3.1 MTT法检测细胞活力
        6.3.2 Western Blotting检测蛋白表达
        6.3.3 数据分析
    6.4 实验结果
        6.4.1 番茄红素和 β-胡萝卜素对癌细胞增殖的影响
        6.4.2 番茄红素和 β-胡萝卜素对经GW9662 预处理细胞增殖的影响
        6.4.3 番茄红素和 β-胡萝卜素对PPARγ 表达的影响
        6.4.4 番茄红素和 β-胡萝卜素对p21WAF1/CIP1、Cyclin D1 和Cox-2 表达的影响
    6.5 讨论
    6.6 小结
7 结论与展望
    7.1 结论
    7.2 创新之处
    7.3 研究展望
参考文献
附录
个人简历和文章发表情况
致谢



本文编号：3480097