用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建

发布时间：2024-04-14 22:49

　　为了进行CRISPR文库筛选,本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a细胞构建表达Cas9蛋白的N2aCas9单克隆细胞系。实验将LentiCas9-Blast、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T)获取高滴度的重组慢病毒,收集重组慢病毒并感染N2a细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。Western blot结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白;利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力;利用CellTiter-Glo试剂检测结果显示,Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。

【文章页数】：4 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 质粒与细胞株
    1.2 主要试剂
    1.3 慢病毒的包装和感染剂量的确定
    1.4 慢病毒转染和N2a表达Cas9蛋白细胞系的获得
    1.5 表达Cas9蛋白的N2a细胞切割活力检测
    1.6 N2a-Cas9细胞活力检测
2 结果与讨论
    2.1 慢病毒感染剂量的确定
    2.2 表达Cas9蛋白N2a细胞系的获得
    2.3 表达Cas9蛋白的N2a细胞切割活力检测结果
    2.4 N2a-Cas9细胞系活性的测定结果



本文编号：3955342