大肠杆菌高效合成3-HP的代谢通路改造

发布时间：2024-03-26 20:26

　　随着石化资源的不断消耗,气候的不断恶化,人们逐渐从石化经济向生物经济转变,利用可再生资源生产高附加值生物制品是实现社会可持续发展和循环经济的必然选择。3-羟基丙酸(3-HP)两次被美国能源部评选为优先开发的化学品之一,以其为前体可合成多种具有商业价值的化合物,被广泛用于材料、化工、医学等领域。目前,3-HP以生物法中基因工程菌合成为主,具有合成产量高、途径易改善等优点。本文使用葡萄糖为唯一碳源,选取遗传背景清晰、廉价易得的大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株构建丙二酸单酰辅酶A途径,通过对代谢通路的改造达到高效合成3-HP的目的。主要内容如下:(1)以实验室保存的质粒为模板,设计3对含同源片段的引物,通过PCR扩增出目的片段,利用重组连接酶构建含丙二酸单酰辅酶A还原酶mcr基因的重组质粒pA2c-mcr,对其进行菌液PCR、酶切及测序验证,并对目的蛋白表达进行验证。(2)为提高丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)的活性,利用定点突变技术设计两对突变引物,构建含多个突变位点(N940V/K1106W/S114R)的重组质粒pA2c-mcr*,菌液PCR及测序验证表明位点已成...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２甘油途径合成３－ＨＰ??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?３－ＨＰ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｏｌ?ｐａｔｈｗａｙ??（ｉ）

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图１－３丙二酸单酰辅酶Ａ途径合成３－ＨＰ??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?３－ＨＰ?ｂｙ?ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ?ｐａｔｈｗａｙ??

?１绪论???羧化成丙二酸单酰辅酶Ａ，再利用２ｍｏｌＮＡＤＰＨ还原成３－ＨＰ。该途径因具有很好地能??量平衡及较高的转化效率被广为研宄。??ｓ?ｃｌ！??Ｇ一－夸八，—＿＞??Ａｃｅｔｖｉ－ＣｏＡ?Ｈ０＞?ＭａｌｃＭｉｖｉ－ＣｏＡ??ＮＡＤＰｆｉ?Ｎ??ＫＡＤＰ＾??ｙ??Ｍａｌ....

图１－４卩－丙氨酸途径合成３－ＨＰ??Ｆｉｇ．?１－４?Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?３－ＨＰ?ｂｙ?ｐ－ａｌａｎｉｎｅ?ｐａｔｈｗａｙ??

３－丙氨酸途径，并获得较高的产量。??Ｇｌｍ：ｏｓｅ?ｑ??、＇▲厂、?Ａ?／＼?ｐ?１??＾ＴＣＡＣｙｃｋ?＿＿＾Ｋ０－??Ｆｕｍａｒａｔｅ?ｐ－ａｌａｎｉｎｅ??ｐ＞ＴＵｖａｒｅ?｜?＾－ａｌａｎｍｅ?ｐ＞Ｔｉｎ＇３ｔｅ??Ｌ－ａｌａｕｍｅ?Ｉ?ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ....

图２－］蛋白质含量标准曲线??Ｆ．－１ａｒｄｒｖｅ?ｏｅｃｎｅ

的ＬＢ液体培养基中３７°Ｃ、２２０?ｒｐｍ／ｍｉｎ过夜培养１２－１６?ｈ，提取质粒并送至测序??公司测序。??２．３．１２蛋白质浓度的测定??本实验采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质浓度。当考马斯亮蓝与蛋白质结合反应后，会在??分光光度计的５９５?ｎｍ处有最大的吸收峰，且测得的吸光....

本文编号：3939638