p53靶向DEPTOR表达的分子机制及功能研究

发布时间：2024-01-20 09:30

　　DEPTOR(DEP-domain containg mTOR-interacting protein)作为mTOR(mammalian target of rapamycin)的结合蛋白,通过与mTOR直接结合并抑制mTORC1和mTORC2的活性,在细胞生长、代谢、凋亡和免疫等多种生物学进程中发挥着关键的调控作用。鉴于DEPTOR对mTOR信号通路重要的调节作用,DEPTOR自身的调控机制十分复杂,越来越多的研究显示,DEPRTOR的转录水平调控高度依赖于特定的细胞类型与内外环境。然而,目前并不清楚DEPTOR在转录水平上是否存在普遍的调控机制。如果能够找到一个转录因子可以在普遍情况下靶向调控DEPTOR表达,或许可以为DEPTOR相关的信号通路及疾病的研究提供新思路。在本研究中,我们运用免疫印迹、染色质免疫沉淀技术、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因技术、基因沉默/敲除等生物化学与分子生物学相关技术发现抑癌基因p53靶向调控DEPTOR表达,抑制细胞生长并减弱化疗敏感性。得出这一结论的关键实验依据为:(1)在体外培养的肿瘤细胞和小鼠体内器官中,DEPTOR的表达水平与p53的...

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缩略词表
1 引言
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系与菌株
        2.1.2 化合物
        2.1.3 抗体
        2.1.4 质粒、siRNA和 sgRNA
        2.1.5 主要试剂耗材
        2.1.6 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 细胞冻存与复苏
        2.2.3 细胞转染
        2.2.4 细胞感染
        2.2.5 细胞计数
        2.2.6 质粒构建与提取
        2.2.7 细胞系的构建
        2.2.8 qRT-PCR
        2.2.9 双荧光素酶报告基因检测
        2.2.10 染色质免疫沉淀技术
        2.2.11 细胞生长实验
        2.2.12 克隆形成实验
        2.2.13 流式细胞仪检测细胞周期实验
        2.2.14 蛋白免疫印迹
        2.2.15 数据分析
3 结果
    3.1 DEPTOR的表达受p53 调控
        3.1.1 p53 活性与DEPTOR的蛋白水平成正相关
        3.1.2 p53 活性与DEPTOR的 m RNA水平成正相关
        3.1.3 缺失p53 下调DEPTOR表达
        3.1.4 小鼠体内器官中,Deptor的表达受到p53 调控
    3.2 p53 直接结合并激活DEPTOR转录
        3.2.1 p53 可以激活DEPTOR的启动子
        3.2.2 p53与DEPTOR启动子上C序列靶向结合并诱导其转录
    3.3 p53 通过诱导DEPTOR的表达抑制细胞生长和存活并减慢细胞周期进程
        3.3.1 p53 以密度依赖的方式调控DEPTOR的表达
        3.3.2 p53 介导的DEPTOR的表达抑制细胞生长和存活
        3.3.3 p53 介导的DEPTOR的表达减慢细胞周期进程
    3.4 p53 介导的DEPTOR表达通过抑制AKT活性来阻碍细胞的生长和存活
        3.4.1 p53 介导的DEPTOR的表达抑制AKT的活性
        3.4.2 抑制AKT活性可以抑制?C-DEPTOR细胞的生长优势
        3.4.3 抑制AKT活性可以抑制?C-DEPTOR细胞的存活优势
    3.5 DOX处理下,p53 介导的DEPTOR的表达抑制细胞凋亡并产生耐药性
        3.5.1 DOX处理能够促进DEPTOR的表达
        3.5.2 DOX以 p53 依赖的方式增加DEPTOR的表达
        3.5.3 p53 介导的DEPTOR的表达减弱肿瘤细胞对DOX的化疗敏感性
        3.5.4 DOX处理下p53 介导的DEPTOR的表达促进细胞凋亡
4 讨论
参考文献
附录 常用缓冲液及培养基配方
综述 DEPTOR 转录调控的研究进展
    参考文献
作者简介及在读期间所取得研究成果



本文编号：3880597