核仁蛋白Rcl1在斑马鱼肝脏发育过程中的功能研究
发布时间：2023-12-10 14:37
Rcl1是一个在酵母中首次被发现并研究的核仁蛋白,在真核生物中具有较高保守性,并作为SSU组装复合体的组份,参与rRNA的加工过程。此外,在人细胞系中也证实RCL1的缺失影响了 rRNA的加工过程。本课题以斑马鱼作为模式生物,对Rcl1在脊椎动物中的功能进行研究。斑马鱼rcl1基因是一个母源基因。在卵子发育时大量储存于成熟的卵细胞中,并在受精后表达水平下降,随着胚胎发育出现一个全身性的表达小高峰,之后伴随表达水平下降表现出消化器官组织特异性的表达模式。在消化器官如肝脏中,Rcl1定位于核仁中。我们运用两个独立的rcl1突变体品系:假性逆转录病毒插入导致的rcl1lacZ突变体以及利用CRISPR/Cas9基因编辑系统产生移码突变的rcl1cas9突变体,检测Rcl1缺失对斑马鱼早期胚胎发育的影响。发现由于Rcl1的缺失,源自内胚层的肝脏、肠道、胰腺、胆囊、鱼鳔以及下颚咽弓软骨的生长发育受到严重阻滞。此外,其他胚层来源的器官发育也受到Rcl1缺失的影响,但没有内胚层器官严重。同时,确认Rcl1在肝脏、胰腺等芽基生长、扩张中具有重要作用。当缺乏Rcl1时,肝实质细胞无法顺利从G2期晚期进入...
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第1章 绪论
1.1 模式生物斑马鱼
1.1.1 模式生物斑马鱼简介
1.1.2 斑马鱼遗传学突变技术简介
1.1.3 斑马鱼肝脏发育
1.2 核仁及rRNA的加工
1.2.1 核仁结构及其功能
1.2.2 核糖体大小亚基
1.2.3 rRNA加工在酵母和人中的差异
1.3 rcl1基因研究进展
第2章 材料与方法
2.1 斑马鱼实验
2.1.1 斑马鱼饲养与繁殖
2.1.2 斑马鱼品系
2.1.3 斑马鱼胚胎显微注射(microinjection)
2.2 常规生化试剂及其配制
2.3 DNA相关实验方法
2.3.1 斑马鱼基因组DNA制备
2.3.2 基因克隆
2.3.3 细胞凋亡实验
2.4 RNA相关实验方法
2.4.1 总RNA提取
2.4.2 DNase I去除RNA样品中的DNA
2.4.3 逆转录实验
2.4.4 实时荧光定量PCR
2.4.5 mRNA体外转录实验
2.4.6 RACE实验
2.4.7 转录组学分析
2.4.8 Northern印迹法(Northern blot)
2.4.9 整胚原位杂交(WISH)
2.5 蛋白质相关实验方法
2.5.1 蛋白样品的制备
2.5.2 蛋白质印迹法(Western Blot)
2.5.3 蛋白免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)
第3章 斑马鱼rcl1基因及其转录本研究
3.1 rcl1基因产物同源性比较
3.2 斑马鱼rcl1基因概述
3.3 斑马鱼rcl1转录本在胚胎期的表达研究
第4章 斑马鱼Rcl1蛋白的抗体制备及其蛋白表达研究
4.1 斑马鱼Rcl1蛋白抗体的制备
4.2 斑马鱼Rcl1蛋白抗体的检测
4.3 斑马鱼Rcl1蛋白在胚胎期的表达研究
第5章 斑马鱼rcl1lacZ和rcl1cas9突变体的获得及其表型的描述
5.1 斑马鱼rcl1lacZ突变体的获得
5.2 斑马鱼rcl1cas9突变体的获得
5.3 斑马鱼rcl1突变体中rcl1基因转录水平及Rcl1蛋白水平的验证
5.4 斑马鱼rcl1突变体中消化器官生长发育受到阻滞
5.5 斑马鱼rcl1突变体中其他器官的发育受到一定影响
第6章 斑马鱼rcl1突变体细胞增殖受阻导致小肝脏表型
6.1 斑马鱼rcl1突变体肝实质细胞的细胞周期受到阻滞
6.2 斑马鱼rcl1突变体肝实质细胞无异常凋亡现象
第7章 斑马鱼Rcl1的缺失影响18S rRNA的加工和成熟过程
7.1 斑马鱼rcl1突变体中18S rRNA大量减少
7.2 斑马鱼rcl1突变体中18S rRNA前体剪切出现异常
7.3 体外酶活实验探究Rcl1的内切酶活性
第8章 斑马鱼rcl1cas9突变体转录组学分析
8.1 测序样品的选定及其制备
8.2 测序数据质量评估
8.3 转录组基因表达量计算及差异表达基因分析
8.4 通过qRT-PCR实验对测序结果进行验证
8.5 GO功能分析
8.6 代谢通路分析
8.7 可变剪切分析
第9章 斑马鱼bms1基因的相关研究
9.1 斑马鱼bms1lzjul突变体的获得
9.2 斑马鱼Bms11蛋白抗体的制备
9.3 斑马鱼Bms11蛋白抗体的检测
9.4 Bms11蛋白在SDS-PAGE上的分子量同其理论分子量的差异研究
第10章 结论与讨论
10.1 结论
10.2 讨论
第11章 参考文献
作者简介
致谢
本文编号：3872600
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第1章 绪论
1.1 模式生物斑马鱼
1.1.1 模式生物斑马鱼简介
1.1.2 斑马鱼遗传学突变技术简介
1.1.3 斑马鱼肝脏发育
1.2 核仁及rRNA的加工
1.2.1 核仁结构及其功能
1.2.2 核糖体大小亚基
1.2.3 rRNA加工在酵母和人中的差异
1.3 rcl1基因研究进展
第2章 材料与方法
2.1 斑马鱼实验
2.1.1 斑马鱼饲养与繁殖
2.1.2 斑马鱼品系
2.1.3 斑马鱼胚胎显微注射(microinjection)
2.2 常规生化试剂及其配制
2.3 DNA相关实验方法
2.3.1 斑马鱼基因组DNA制备
2.3.2 基因克隆
2.3.3 细胞凋亡实验
2.4 RNA相关实验方法
2.4.1 总RNA提取
2.4.2 DNase I去除RNA样品中的DNA
2.4.3 逆转录实验
2.4.4 实时荧光定量PCR
2.4.5 mRNA体外转录实验
2.4.6 RACE实验
2.4.7 转录组学分析
2.4.8 Northern印迹法(Northern blot)
2.4.9 整胚原位杂交(WISH)
2.5 蛋白质相关实验方法
2.5.1 蛋白样品的制备
2.5.2 蛋白质印迹法(Western Blot)
2.5.3 蛋白免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)
第3章 斑马鱼rcl1基因及其转录本研究
3.1 rcl1基因产物同源性比较
3.2 斑马鱼rcl1基因概述
3.3 斑马鱼rcl1转录本在胚胎期的表达研究
第4章 斑马鱼Rcl1蛋白的抗体制备及其蛋白表达研究
4.1 斑马鱼Rcl1蛋白抗体的制备
4.2 斑马鱼Rcl1蛋白抗体的检测
4.3 斑马鱼Rcl1蛋白在胚胎期的表达研究
第5章 斑马鱼rcl1lacZ和rcl1cas9突变体的获得及其表型的描述
5.1 斑马鱼rcl1lacZ突变体的获得
5.2 斑马鱼rcl1cas9突变体的获得
5.3 斑马鱼rcl1突变体中rcl1基因转录水平及Rcl1蛋白水平的验证
5.4 斑马鱼rcl1突变体中消化器官生长发育受到阻滞
5.5 斑马鱼rcl1突变体中其他器官的发育受到一定影响
第6章 斑马鱼rcl1突变体细胞增殖受阻导致小肝脏表型
6.1 斑马鱼rcl1突变体肝实质细胞的细胞周期受到阻滞
6.2 斑马鱼rcl1突变体肝实质细胞无异常凋亡现象
第7章 斑马鱼Rcl1的缺失影响18S rRNA的加工和成熟过程
7.1 斑马鱼rcl1突变体中18S rRNA大量减少
7.2 斑马鱼rcl1突变体中18S rRNA前体剪切出现异常
7.3 体外酶活实验探究Rcl1的内切酶活性
第8章 斑马鱼rcl1cas9突变体转录组学分析
8.1 测序样品的选定及其制备
8.2 测序数据质量评估
8.3 转录组基因表达量计算及差异表达基因分析
8.4 通过qRT-PCR实验对测序结果进行验证
8.5 GO功能分析
8.6 代谢通路分析
8.7 可变剪切分析
第9章 斑马鱼bms1基因的相关研究
9.1 斑马鱼bms1lzjul突变体的获得
9.2 斑马鱼Bms11蛋白抗体的制备
9.3 斑马鱼Bms11蛋白抗体的检测
9.4 Bms11蛋白在SDS-PAGE上的分子量同其理论分子量的差异研究
第10章 结论与讨论
10.1 结论
10.2 讨论
第11章 参考文献
作者简介
致谢
本文编号：3872600
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