基于滚环转录方法构建的RNA自组装纳米结构的siRNA递送研究

发布时间：2020-05-18 18:06

【摘要】：RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为转录后调节机制,可靶向mRNA进行剪切降解从而发挥基因沉默效应。siRNA(small interference RNA)因其高效性和特异性而被广泛应用于药物研究中。目前,研究者们已开发了多种阳离子载体用于siRNA递送。但由于siRNA双链结构具有相对较强的刚性结构,且阴离子电荷密度较低,无法与阳离子载体形成稳定、致密的复合物,使得siRNA的应用仍面临诸多挑战,如细胞摄取率低、靶向特异性差、递送过程不稳定、潜在的细胞毒性以及易诱发免疫反应等。近年来,核酸自组装纳米结构由于其结构灵活且负电荷密度较高而受到广泛关注,有望实现siRNA药物的高效递送和基因沉默。本文致力于开发一种新的转录模板来构建核酸自组装纳米微球,并对纳米微球的结构特征、细胞摄取以及基因调控功能进行研究。(1)本研究设计并合成了哑铃型环状DNA模板,利用滚环转录(rolling circle transcription,RCT)技术,合成poly-RNA。通过碱基互补配对,poly-RNA进一步自组装,并与转录过程中形成的焦磷酸镁晶体结合,形成海绵状RNA纳米微球(RNA nanoparticles,RNP)。琼脂糖凝胶电泳分析实验初步验证了poly-RNA的形成。(2)本研究对纳米微球的组成、粒径、表面电势、结构及稳定性等进行了一系列表征。纳米微球呈海绵微孔球状结构。粒子大小与转录过程中的Mg~(2+)浓度有关,Mg~(2+)浓度由6 mM提高至15 mM时,纳米微球的粒径由2μm~3.5μm降至1μm左右。根据Zeta电位测量结果,纳米微球的表面电势为-12~-14 mV。血清稳定性实验表明相比天然的siRNA,纳米微球具有更好的稳定性。随着时间的延长,对照组siRNA在6小时内降解到20%左右,24小时内几乎降解完全,而RNP降解速度相对于siRNA更慢,24小时后仍有40%未被降解。(3)siRNA的细胞摄取与溶酶体逃逸过程是其发挥有效的基因沉默调控的关键过程。因此,本课题研究了HepG2细胞对纳米微球的摄取过程,以及纳米微球进入细胞后的溶酶体逃逸过程。相比天然的siRNA,纳米微球的细胞摄取效率更高,且在转染12小时后能够从溶酶体中逃逸出来。最后我们证实了纳米微球实现了对绿色荧光蛋白基因的表达沉默调控。
【图文】：

作用机制

图 1.1 siRNA 作用机制[14]naute (Ago)蛋白在 RNA 干扰过程中起着非常重要的作用，，Ag子质量约为十万的结构高度保守的碱性蛋白家族。人类体内表go3 和 Ago4 四个亚型，在哺乳动物体内只有 Ago2 具有核酸内扰过程中起着重要作用[15]。如图 1.2 所示，Ago2 基本结构模N 末端和 MID 结构域组成新月形的底座，PAZ 结构域由茎状结的上方[16]。PIWI 由 300 个非常保守的氨基酸构成，含有类似 R，负责剪切靶向 mRNA[17]。PAZ 区域是一个疏水区域，依靠氢NA 结合，能够识别 siRNA 的 3′末端悬垂，决定了 RNA 诱导induced silencing complex, RISC)的向导功能[18]。N-lobe 则是作旋和 RISC 激活中发挥重要作用[19]。MID 结构域能够使 Ag 7-甲基鸟嘌呤结合，从而抑制 mRNA 的转录起始[20]。

示意图,蛋白结构,示意图,结构域

图 1.1 siRNA 作用机制[14] (Ago)蛋白在 RNA 干扰过程中起着非常重要的作用约为十万的结构高度保守的碱性蛋白家族。人类体 Ago4 四个亚型，在哺乳动物体内只有 Ago2 具有核程中起着重要作用[15]。如图 1.2 所示，Ago2 基本结和 MID 结构域组成新月形的底座，PAZ 结构域由[16]。PIWI 由 300 个非常保守的氨基酸构成，含有剪切靶向 mRNA[17]。PAZ 区域是一个疏水区域，合，能够识别 siRNA 的 3′末端悬垂，决定了 RNd silencing complex, RISC)的向导功能[18]。N-lobe 则RISC 激活中发挥重要作用[19]。MID 结构域能够基鸟嘌呤结合，从而抑制 mRNA 的转录起始[20]。
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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