多浆旱生植物霸王HKT转运蛋白的功能研究
发布时间：2020-04-02 15:35
【摘要】：干旱是世界农业面临的主要非生物胁迫之一,全球约25%的农业用地受到干旱胁迫的影响。我国是受干旱影响最严重的国家之一,干旱半干旱地区占国土面积的50.8%,并且主要分布于西北地区。生长于西北干旱半干旱地区的荒漠旱生植物在长期的演化过程中形成了独特的抗旱机制,蕴含着丰富的抗逆基因资源。本课题组对西北荒漠区植被组成的优势种多浆旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的研究显示,其可从有效Na~+含量极低的干旱土壤中吸收大量Na~+,并由质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白ZxSOS1将根系吸收的大量Na~+长距离上运至叶,通过液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白ZxNHX1将其区域化于叶肉细胞的液泡中作为有益的渗透调节剂以抵御逆境胁迫,表明霸王体内具有独特的Na~+转运机制。但对于霸王根系如何从含盐量极低的土壤中吸收大量Na~+、根中Na~+如何被卸载以及上运至叶脉中的Na~+又是如何从质外体空间装载到叶肉细胞,上述过程目前均不清楚。HKT转运蛋白是高等植物细胞质膜上介导Na~+内流的候选者,并且在维持体内Na~+稳态中发挥重要作用,但其在霸王中的功能尚未被系统和深入地报道。因此,本论文通过对霸王转录组中HKT家族基因的分析,克隆了霸王HKT转运蛋白编码基因,并通过烟草瞬时表达、酵母与爪蟾卵母细胞中的异源表达、qRT-PCR、原位PCR以及在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的超表达等方法,分析了霸王HKT转运蛋白的功能,取得如下主要结果:1.霸王转录组中存在Unigene13502_All等9个可能编码HKT转运蛋白的Unigenes,其中,编号为Unigene11474_All的Unigene在根中的表达受盐处理和渗透胁迫的显著诱导而上调,编号为CL4173.Contig2_All的Unigene在叶中的表达受渗透胁迫影响而下调。2.基于转录组分析,以Unigene13502_All的序列为核心序列,克隆到霸王ZxHKT1;1编码基因的全长cDNA,进化树分析显示ZxHKT1;1属于HKT第一亚族,与冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)McHKT1;1的进化关系较近。烟草瞬时表达显示ZxHKT1;1定位于质膜。ZxHKT1;1在酵母中为Na~+转运蛋白,不介导K~+的吸收;ZxHKT1;1在爪蟾卵母细胞中特异性地转运Na~+,不介导Li~+、K~+、Cs~+和NH_4~+的吸收。ZxHKT1;1主要在根中表达,原位PCR结果显示ZxHKT1;1主要在根的木质部薄壁细胞中高丰度表达。用35S启动子驱动的ZxHKT1;1在拟南芥athkt1;1突变体株系中的表达,无法回补其因AtHKT1;1的缺失导致的盐敏感表型,而利用AtHKT1;1启动子组织特异性表达ZxHKT1;1,不仅可回补athkt1;1突变体的盐敏感表型,也可增强野生型拟南芥的耐盐性,表明ZxHKT1;1介导根木质部汁液中的Na~+卸载到木质部薄壁细胞中,且其功能的发挥具有组织特异性。进一步研究发现,在霸王最适生长的50 mM NaCl处理下,ZxHKT1;1在根中的表达量下降,这有利于将Na~+转运到植株地上部进而区域化于液泡中发挥渗透调节作用;但在150 mM NaCl的高盐处理下,ZxHKT1;1在根中的表达量显著上调,这有助于减少Na~+向植株地上部的转运和过量积累。3.以转录组中Unigene11474_All的序列为核心序列,克隆了ZxHKT1;2全长cDNA,进化树分析显示ZxHKT1;2属于HKT第一亚族,与桉树(Eucalyptus camaldulensis)EcHKT1;2的同源性较高。烟草瞬时表达显示其定位于质膜。ZxHKT1;2在酵母和爪蟾卵母细胞中介导Na~+的吸收、不介导K~+的吸收。qRT-PCR结果表明,ZxHKT1;2主要在根中表达,50和150 mM NaCl能够诱导其表达量升高,且前者对其诱导程度更高。原位PCR结果显示ZxHKT1;2主要在根表皮和皮层细胞中高丰度表达。基于以上结果,推测ZxHKT1;2介导霸王根系Na~+的吸收。4.以转录组中CL4173.Contig2_All的序列为核心序列,克隆到ZxHKT1;3转运蛋白编码基因的全长cDNA,进化树分析显示其属于HKT第一亚族,与霸王ZxHKT1;2的进化关系最近。烟草瞬时表达显示其定位于质膜。ZxHKT1;3在酵母中既不介导Na~+的转运,也不介导K~+的吸收;在爪蟾卵母细胞中的异源表达显示其特异性介导Na~+的吸收,不介导其他一价阳离子的吸收。qRT-PCR结果表明,ZxHKT1;3主要在霸王叶中表达,在50和150 mM NaCl处理下,其表达量迅速上调,并且150 mM NaCl对其诱导更为强烈。在拟南芥中的GUS染色结果显示,ZxHKT1;3于叶中的细脉游离端的维管组织和周围的叶肉细胞处特异性表达。根据上述结果,推测ZxHKT1;3介导霸王叶肉细胞中Na~+的装载。以上结果揭示了HKT转运蛋白在多浆旱生植物霸王Na~+吸收与转运中的功能,加深了对霸王体内独特的Na~+转运机制的认识,为优良牧草和农作物抗逆性的遗传改良提供理论依据。
【图文】：
根据 Compute PI/MW 在线软件进行分析，推测其分子量为 59.3 kDa，pI 为 9.28；根据 TMHMM 在线软件对该基因编码的氨基酸序列进行疏水域分析，发现其包含 10 个跨膜域(图 3-3)。运用 MEGA6 构建的系统进表明其属于 HKT 第一亚族(图 3-4)，参考 Platten 等(2006)和 Hauser 等(名原则，将该基因命名为 ZxHKT1;1。霸王 ZxHKT1;1 与冰叶日esembryanthemum crystallinum) McHKT1;1 和毛果杨 (Populus trichocKT1;1 的进化关系较近(图 3-4)。运用 DNAMAN 软件对不同物种 HKT列进行多重比对，发现霸王 ZxHKT1;1 与其他高等植物 HKT 转运蛋白成员具有较高的同源性，与冰叶日中花 McHKT1;1 和模式植物拟KT1;1 的同源性分别为 49%和 46% (图 3-5)。运用 InterProScan 在线软件KT1;1 包含 4 个 P 环，具有 4 个 MPM 结构，并且在第一个 P 环过滤器氨基酸残基为 Ser，其余三处均为 Gly (图 3-5)，这符合 HKT 第一亚族Platten 等，2006)。与此同时，由图 3-5 可看出在决定盐芥 TsHKT1;2 是转运蛋白的氨基酸位点处(Ali 等，2016)，ZxHKT1;1 的氨基酸残基均是冬氨酸的天冬酰胺，这与 AtHKT1;1 相同，因此推测其可能是 Na+转运蛋
55图 3-10 ZxHKT1;1 在爪蟾卵母细胞中的功能分析Fig. 3-10 Functional analysis of ZxHKT1;1 in X. laevis oocytes：(A、B)：注射水、ZxHKT1;1 的 cRNA 的单个爪蟾卵母细胞在含有 20 mM NaCl 和 KCl B液中的电流图；(C、D)：在分别含有 4、1、8 和 16 mM Na+的 Bath 溶液中，-120 mV下的电流振幅；(E、F)：ZxHKT1;1 的阳离子选择性，，在分别含有 20 mM Li+、Na+、Ks+和 NH4+的 Bath 溶液中，-60 mV 条件下的电流振幅；(G)：ZxHKT1;1 的时间依赖性及学；(H)：注射 ZxHKT1;1 的爪蟾卵母细胞分别在 0.3 mM K+和不同浓度 Na+(3 和 10 m及 0.3 mM Na+和不同浓度 K+(0.3、3 和 10 mM)的 Bath 溶液中的电压、电流值。数值为值±标准差(n=5)。ote: (A, B), Typical whole-cell currents recorded by hyperpolarized pulses from the oocynjected with water or oocytes expressing ZxHKT1;1 perfused with the bath solution contain0 mM NaCl and KCl. (C, D), Steady-state current amplitudes were recorded at -120 mV in ath solution containing 4, 1, 8, and 16 mM Na+. (E, F), Cation selectivity of ZxHKT1teady-state current amplitudes were recorded at -60 mV in the bath solution containing 20 mi+, Na+, K+, Cs+and NH4+respectively. (G), Time dependency and activation kinetics in urrents generated by ZxHKT1;1. (H), Oocytes expressing ZxHKT1;1 were voltage-clamped
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2
本文编号：2612133
【图文】：
根据 Compute PI/MW 在线软件进行分析，推测其分子量为 59.3 kDa，pI 为 9.28；根据 TMHMM 在线软件对该基因编码的氨基酸序列进行疏水域分析，发现其包含 10 个跨膜域(图 3-3)。运用 MEGA6 构建的系统进表明其属于 HKT 第一亚族(图 3-4)，参考 Platten 等(2006)和 Hauser 等(名原则，将该基因命名为 ZxHKT1;1。霸王 ZxHKT1;1 与冰叶日esembryanthemum crystallinum) McHKT1;1 和毛果杨 (Populus trichocKT1;1 的进化关系较近(图 3-4)。运用 DNAMAN 软件对不同物种 HKT列进行多重比对，发现霸王 ZxHKT1;1 与其他高等植物 HKT 转运蛋白成员具有较高的同源性，与冰叶日中花 McHKT1;1 和模式植物拟KT1;1 的同源性分别为 49%和 46% (图 3-5)。运用 InterProScan 在线软件KT1;1 包含 4 个 P 环，具有 4 个 MPM 结构，并且在第一个 P 环过滤器氨基酸残基为 Ser，其余三处均为 Gly (图 3-5)，这符合 HKT 第一亚族Platten 等，2006)。与此同时，由图 3-5 可看出在决定盐芥 TsHKT1;2 是转运蛋白的氨基酸位点处(Ali 等，2016)，ZxHKT1;1 的氨基酸残基均是冬氨酸的天冬酰胺，这与 AtHKT1;1 相同，因此推测其可能是 Na+转运蛋
55图 3-10 ZxHKT1;1 在爪蟾卵母细胞中的功能分析Fig. 3-10 Functional analysis of ZxHKT1;1 in X. laevis oocytes：(A、B)：注射水、ZxHKT1;1 的 cRNA 的单个爪蟾卵母细胞在含有 20 mM NaCl 和 KCl B液中的电流图；(C、D)：在分别含有 4、1、8 和 16 mM Na+的 Bath 溶液中，-120 mV下的电流振幅；(E、F)：ZxHKT1;1 的阳离子选择性，，在分别含有 20 mM Li+、Na+、Ks+和 NH4+的 Bath 溶液中，-60 mV 条件下的电流振幅；(G)：ZxHKT1;1 的时间依赖性及学；(H)：注射 ZxHKT1;1 的爪蟾卵母细胞分别在 0.3 mM K+和不同浓度 Na+(3 和 10 m及 0.3 mM Na+和不同浓度 K+(0.3、3 和 10 mM)的 Bath 溶液中的电压、电流值。数值为值±标准差(n=5)。ote: (A, B), Typical whole-cell currents recorded by hyperpolarized pulses from the oocynjected with water or oocytes expressing ZxHKT1;1 perfused with the bath solution contain0 mM NaCl and KCl. (C, D), Steady-state current amplitudes were recorded at -120 mV in ath solution containing 4, 1, 8, and 16 mM Na+. (E, F), Cation selectivity of ZxHKT1teady-state current amplitudes were recorded at -60 mV in the bath solution containing 20 mi+, Na+, K+, Cs+and NH4+respectively. (G), Time dependency and activation kinetics in urrents generated by ZxHKT1;1. (H), Oocytes expressing ZxHKT1;1 were voltage-clamped
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2
本文编号：2612133
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2612133.html