低浓度混合抗生素对普通小球藻的联合毒性效应及机理

发布时间：2020-04-02 03:18

【摘要】：药物与个人护理品(PPCPs)作为一大类新型环境污染物,种类繁杂,使用量巨大,它们的环境行为和毒理效应近年来受到人们越来越多的重视。其中,抗生素类化合物在各类环境中被频繁检出,且具有一定生物活性,对各类生物及人体健康造成潜在风险,但其生态毒理数据严重不足。在水环境中,各类抗生素往往呈“混合-持久-低剂量”的暴露特征,但目前大多数研究仅集中在高剂量抗生素的单独生物毒性,联合毒性的研究极其匮乏。因此,亟需开展低浓度混合抗生素对水生生物的联合毒性研究。本论文以红霉素(erythromycin,ERY)、恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)和磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,SMX)三种常见的抗生素做为目标化合物,研究它们对非靶标生物普通小球藻(Chlorella vulgaris)的单独以及联合毒性效应。在此基础上,选择其中毒性相对较大的两种ERY和ENR,从小球藻对它们的生理响应出发并深入到基因转录水平,探索低浓度混合抗生素对C.vulgaris的联合作用机理,主要得出如下结果:(1)几种抗生素对小球藻的基础毒性试验结果表明:ERY、ENR和SMX对C.vulgaris的96 h-EC_(50)分别为86、125和1 673μg/L,故毒性大小顺序为ERYENRSMX。但在较低浓度时,它们都显著促进了藻类生长。联合毒性实验结果表明,三种抗生素两两联合暴露时,对C.vulgaris的联合毒性作用类型均为协同效应。(2)小球藻抗氧化防御系统的研究发现:ERY和ENR的暴露使C.vulgaris体内丙二醛(MDA)含量升高,这表明两种抗生素均对C.vulgaris造成了氧化损伤。另外,C.vulgaris体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)以及谷胱甘肽还原酶(GR)的活性也均出现不同程度的升高。还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量的升高也表明了抗生素的暴露使C.vulgaris受到了氧化胁迫。联合毒性实验表明,ERY和ENR联合可以协同地增加抗氧化酶的活性以及MDA、GSH和GSSG的含量。(3)小球藻三种光合作用相关基因(psaB、psbC和chlB)的表达量的研究发现:实时荧光定量PCR技术检测出的三种基因的转录丰度在ERY和ENR的作用下均有升高的趋势,并且两者联合可以协同增加三种基因的转录丰度。叶绿素含量在两种抗生素的作用下出现了低促高抑的现象,即低浓度(0.03 mg/L)时刺激叶绿素合成,高浓度时(1 mg/L)抑制,但两种抗生素在低浓度联合时可以显著抑制叶绿素的含量。综合以上研究结果,我们发现ERY、ENR和SMX对C.vulgaris的生长的影响也表现为“低促高抑”现象,并且它们两两联合时具有显著协同作用。低浓度ERY和ENR联合时的作用机理可以从小球藻的抗氧化防御系统和光合基因表达中得到启发和印证。该研究为低浓度混合抗生素在淡水环境中联合暴露的生态风险评估提供科学依据。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳

浓度抗生素作用下升高相一致，这可能是出现了低促高抑的毒性兴奋效应（详见第二章内容）。藻细胞在抵御外界不良刺激的过程中可能需要额外的能量，因此通过提高叶绿素含量来加强光合作用，但是当外界刺激大到一定程度时，就会直接抑制藻细胞叶绿素的合成。低浓度红霉素和恩诺沙星分别以单独和联合的方式作用时叶绿素含量的变化存在较大差异，，这表明两者共存时发生了相互作用，结果显示两者联合时能够显著抑制叶绿素的合成，表明联合作用可以增强两种抗生素对藻类的毒性作用，可能会对水生生态系统造成更严重的环境风险。4.3.2 RNA 纯度及浓度检测本实验通过琼脂糖凝胶电泳以及检测 OD260/OD280 值来判断提取 RNA 的纯度以及完整性。图 4-4 为提取 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图，可以看出每个样品的条带明亮且边缘整齐，说明 RNA 没有被污染。表 4-7 显示了 RNA 浓度及 OD值，其中每个样品的 OD260/OD280 均在 1.8~2.1 之间，表明样品 RNA 纯度较高。

示意图,光合电子传递,过程,示意图

基因被抑制最终可能会对碳同化造成影响，从而抑制光合作用psaB 转录丰度在两种抗生素的刺激下有所增加，这表明藻细能会提高，PSI 反应活性提高可能是由于 PSI 周围的循环电子致 ATP 合成增加、NADPH 合成减少[127]。同时，这种循环电合成抗应激分子提高额外的能量，提高机体对外界不良刺激的是生物体抵御外界胁迫的防御机制[87]。此外，当电子传递在藻细胞可能会增加 PSI 反应相关蛋白质的表达来增强接收电子能是造成 psaB 基因转录丰度升高的原因。崔晗[110]研究发现在素的共同作用下铜绿微囊藻的 psaB 基因表达量上升，并认为到外界不良刺激后作出的应激反应，当 PSI 反应中心蛋白被破合成新的蛋白来弥补抗生素造成的损伤，从而刺激 psaB 表达因的表达量在抗生素的刺激下也出现了升高，并且随抗生素浓用有所削减，这一点与叶绿素含量的变化相一致，这也进一步细胞叶绿素合成具有毒性兴奋效应。
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X171.5

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