高sn-1,3特异性脂肪酶ROL的制备、改造及应用
发布时间：2024-04-17 18:51
甘油二酯是甘油上的两个羟基与两分子的脂肪酸酯化得到的产物,包括1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯两种形式。其中,富含1,3-甘油二酯的油脂具有防止肥胖、降血脂、降血压等多种生理功能,因而被认为是“特定健康用食品”。同时,1,3-甘油二酯又是合成一些化合物(如结构脂1,3-二油酰基-2-棕榈酰甘油酯等)的重要原料。由于天然油脂中1,3-甘油二酯的含量很低,所以其催化合成的研究显得尤为重要。在生物催化制备1,3-甘油二酯的研究中,往往由于酶的选择性、酶活力、反应程度和分离纯化等方面存在一定的缺陷,导致产品中1,3-甘油二酯的含量较低,这严重影响了产品的广泛应用。酰基迁移现象普遍存在于甘油二酯的制备和储存中。本论文首先研究了 1,3-甘油二酯在不同温度下的酰基迁移情况,初步确定酶法制备1,3-甘油二酯的温度为30℃。在此温度下,研究了不同脂肪酶的区域选择性,获得在催化油酸与甘油的酯化反应中具有最高的1,3-区域选择性的脂肪酶ROL(Rhizopus oryzaelipase),其对1,3-甘油二酯的选择性>97%。为强化脂肪酶ROL在油酸与甘油的酯化反应体系中的催化性能和重复利用性能,...
【文章页数】：147 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 甘油二酯的概述
1.1.1 甘油二酯的结构
1.1.2 甘油二酯的营养价值及应用
1.1.3 1,3-甘油二酯的制备方法
1.1.3.1 甘油解法制备1,3-甘油二酯
1.1.3.2 水解法制备1,3-甘油二酯
1.1.3.3 酯交换法制备1,3-甘油二酯
1.1.3.4 酯化法制备1,3-甘油二酯
1.1.4 甘油二酯的酰基迁移
1.2 脂肪酶的概述
1.2.1 脂肪酶概述
1.2.2 脂肪酶的结构特征和催化机理
1.2.3 脂肪酶的选择性
1.2.3.1 脂肪酸或酰基供体的选择性
1.2.3.2 区域或位置选择性
1.2.3.3 立体选择性
1.2.4 脂肪酶的界面激活效应
1.3 脂肪酶的固定化
1.3.1 吸附法
1.3.2 包埋法
1.3.3 共价交联法
1.3.4 偶联法
1.3.5 纳米材料在脂肪酶的固定化中的应用
1.4 脂肪酶的异源表达
1.5 酶的热稳定性改造
1.5.1 基于非理性设计的热稳定性改造
1.5.2 基于半理性设计的热稳定性改造
1.5.3 基于理性设计的热稳定性改造
1.5.3.1 基于二硫键的理性设计
1.5.3.2 基于同源比对的策略
1.5.3.3 基于温度因子的热稳定性改造
1.5.3.4 基于氨基酸残基极性的理性设计
1.5.3.5 酶的热稳定性改造的常用软件
1.5.4 分子动力学的应用
1.6 本课题的研究思路与主要内容
1.6.1 研究思路
1.6.2 研究内容
第二章 高选择性脂肪酶的筛选及其固定化
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料与试剂
2.2.2 分析方法
2.2.2.1 薄层层析法
2.2.2.2 高效液相色谱法
2.2.2.3 脂肪酶蛋白含量的测定
2.2.3 高区域选择性脂肪酶的筛选
2.2.3.1 1,3-甘油二酯酰基迁移的研究
2.2.3.2 脂肪酶的筛选
2.2.4 脂肪酶的固定化
2.2.4.1 纳米四氧化三铁的制备
2.2.4.2 纳米四氧化三铁的表面修饰
2.2.4.3 纳米四氧化三铁的表征
2.2.4.4 脂肪酶的固定化
2.2.4.5 脂肪酶活力的测定
2.2.5 固定化脂肪酶的酶学性质研究
2.2.5.1 pH对脂肪酶活力的影响
2.2.5.2 游离酶和固定化酶的底物特异性
2.2.5.3 游离酶和固定化酶的热稳定性
2.2.5.4 游离酶和固定化酶的动力学性质研究
2.3 结果与讨论
2.3.1 不同温度下1,3-甘油二酯的酰基迁移
2.3.2 脂肪酶的筛选
2.3.3 脂肪酶ROL催化的油酸甘油的酯化反应
2.3.4 四氧化三铁载体的制备与表征
2.3.4.1 场发射透射电子显微镜(TEM)分析
2.3.4.2 傅利叶红外光谱(FT-IR)分析
2.3.4.3 X射线多晶衍射仪分析(XRD)分析
2.3.4.4 磁学性质分析
2.3.5 脂肪酶ROL的固定化
2.3.5.1 表面活性剂等添加剂对固定化的影响
2.3.5.2 pH对固定化的影响
2.3.5.3 蛋白质浓度对固定化的影响
2.3.5.4 蔗糖酯添加量对固定化的影响
2.3.5.5 固定化时间对固定化的影响
2.3.6 固定化酶和游离酶的性质比较
2.3.6.1 pH对游离酶和固定化酶比活力的影响
2.3.6.2 固定化酶和游离酶的底物特异性比较
2.3.6.3 固定化酶和游离酶的热稳定性比较
2.3.6.4 固定化酶和游离酶的水解动力学研究
2.4 本章小结
第三章 固定化脂肪酶催化制备高纯度1,3-二油酸甘油酯
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 反应装置的设计
3.2.3 固定化脂肪酶催化制备1,3-二油酸甘油酯的单因素优化
3.2.4 固定化酶的重复利用
3.2.5 反应产物的分离纯化
3.2.5.1 甲醇结晶法
3.2.5.2 乙醇结晶法
3.2.5.3 碱中和法
3.3 结果与讨论
3.3.1 Fe3O4固定化酶制备高纯度1,3-二油酸甘油酯
3.3.1.1 不同摩尔比的油酸甘油对酯化反应的影响
3.3.1.2 温度对酯化反应的影响
3.3.1.3 固定化酶的添加量对酯化反应的影响
3.3.1.4 除水方式对酯化反应的影响
3.3.1.5 反应体系真空度对酯化反应的影响
3.3.1.6 搅拌速度对反应的影响
3.3.1.7 游离酶和固定化酶酯化效果的比较
3.3.2 游离酶和固定化酶的重复利用性能
3.3.3 酯化产物的分离纯化
3.3.3.1 结晶法
3.3.3.2 碱中和法
3.4 本章小结
第四章 脂肪酶ROL在毕赤酵母中的异源表达
4.1 前言
4.2 材料和方法
4.2.1 质粒和菌种
4.2.2 试剂和试剂盒
4.2.3 试剂的配制
4.2.4 培养基的配制
4.2.5 实验方法
4.2.5.1 基因的获取和密码子优化
4.2.5.2 重组质粒的构建和大肠杆菌的转化
4.2.5.3 线性化质粒的准备
4.2.5.4 毕赤酵母感受态的制备
4.2.5.5 毕赤酵母的电转化及筛选
4.2.5.6 毕赤酵母重组子的验证
4.2.5.7 重组毕赤酵母的诱导表达
4.2.5.8 毕赤酵母发酵液的酶活力测定
4.2.5.9 SDS-PAGE蛋白电泳检测
4.2.5.10 重组脂肪酶的区域选择性测定
4.2.5.11 重组脂肪酶的性质研究
4.3 结果与讨论
4.3.1 密码子的优化结果
4.3.2 重组质粒的构建
4.3.3 毕赤酵母的电转化结果
4.3.4 脂肪酶ROL的异源表达结果
4.3.5 重组脂肪酶ROL催化的区域选择性
4.3.6 脂肪酶ProROL的性质研究
4.3.6.1 脂肪酶ProROL的最适反应pH
4.3.6.2 脂肪酶ProROL的最适反应温度
4.3.6.3 脂肪酶ProROL的热稳定性
4.3.6.4 脂肪酶ProROL的溶剂耐受性
4.4 本章小结
第五章 脂肪酶ROL的热稳定性改造及表达强化
5.1 前言
5.2 材料和方法
5.2.1 质粒和菌种
5.2.2 试剂和试剂盒
5.2.3 试剂的配制
5.2.4 培养基的配制
5.2.5 实验方法
5.2.5.1 多序列比对
5.2.5.2 二硫键的设计
5.2.5.3 突变方法
5.2.5.4 重组大肠杆菌的构建
5.2.5.5 重组毕赤酵母的构建及高拷贝重组子的筛选
5.2.5.6 脂肪酶ROL的诱导表达
5.2.5.7 酶的热稳定性等性质的测定
5.2.5.8 突变体的同源建模
5.2.5.9 脂肪酶ROL及其突变体的分子动力学(MD)模拟
5.2.5.10 热稳定性强化的突变体的应用初探
5.3 结果和讨论
5.3.1 多序列比对结果
5.3.2 基于同源建模的理论分析
5.3.3 二硫键的理性设计
5.3.4 ProROL和E190C/E238C在分子水平上的构象变化
5.3.5 通过热点和二硫键的组合突变提高热稳定性
5.3.6 四点组合突变体热稳定性提高的机理解释
5.3.7 四点突变体的酶学性质
5.3.7.1 最适pH
5.3.7.2 最适反应温度
5.3.7.3 溶剂耐受性
5.3.7.4 动力学常数
5.3.8 四点突变体高拷贝转化子的筛选和诱导表达
5.3.8.1 高拷贝转化子的筛选
5.3.8.2 不同拷贝数的转化子的诱导表达
5.3.9 四点突变体的固定化和应用初探
5.3.9.1 四点突变体(V209L/D262G/E190C/E238C)的固定化
5.3.9.2 四点突变体及其固定化酶的应用
5.4 本章小结
第六章 脂肪酶ROL的区域选择性机制
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 口袋打开的脂肪酶结构的同源建模
6.2.2 蛋白和配体文件的准备
6.2.3 蛋白质-配体的分子对接
6.2.4 蛋白质-配体的分子动力学(MD)模拟
6.2.5 分子动力学计算结果的分析
6.3 结果与讨论
6.3.1 脂肪酶ROL的同源建模
6.3.2 脂肪酶ROL的区域选择性机理解释
6.3.2.1 脂肪酶ROL与甘油二酯的分子对接
6.3.2.2 酶与甘油二酯复合物的分子动力学模拟结果
6.3.2.3 脂肪酶ROL与甘油单酯的对接
6.3.2.4 酶与甘油单酯复合物的分子动力学模拟结果
6.4 本章小结
第七章 总结与展望
7.1 总结
7.2 展望
参考文献
附录Ⅰ 根据毕赤酵母密码子偏好性做优化的脂肪酶ROL的基因序列
附录Ⅱ 脂肪酶ROL完整的氨基酸序列
附录Ⅲ 本论文所用的仪器设备列表
在学期间所取得的科研成果
本文编号：3956777
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致谢
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 甘油二酯的概述
1.1.1 甘油二酯的结构
1.1.2 甘油二酯的营养价值及应用
1.1.3 1,3-甘油二酯的制备方法
1.1.3.1 甘油解法制备1,3-甘油二酯
1.1.3.2 水解法制备1,3-甘油二酯
1.1.3.3 酯交换法制备1,3-甘油二酯
1.1.3.4 酯化法制备1,3-甘油二酯
1.1.4 甘油二酯的酰基迁移
1.2 脂肪酶的概述
1.2.1 脂肪酶概述
1.2.2 脂肪酶的结构特征和催化机理
1.2.3 脂肪酶的选择性
1.2.3.1 脂肪酸或酰基供体的选择性
1.2.3.2 区域或位置选择性
1.2.3.3 立体选择性
1.2.4 脂肪酶的界面激活效应
1.3 脂肪酶的固定化
1.3.1 吸附法
1.3.2 包埋法
1.3.3 共价交联法
1.3.4 偶联法
1.3.5 纳米材料在脂肪酶的固定化中的应用
1.4 脂肪酶的异源表达
1.5 酶的热稳定性改造
1.5.1 基于非理性设计的热稳定性改造
1.5.2 基于半理性设计的热稳定性改造
1.5.3 基于理性设计的热稳定性改造
1.5.3.1 基于二硫键的理性设计
1.5.3.2 基于同源比对的策略
1.5.3.3 基于温度因子的热稳定性改造
1.5.3.4 基于氨基酸残基极性的理性设计
1.5.3.5 酶的热稳定性改造的常用软件
1.5.4 分子动力学的应用
1.6 本课题的研究思路与主要内容
1.6.1 研究思路
1.6.2 研究内容
第二章 高选择性脂肪酶的筛选及其固定化
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料与试剂
2.2.2 分析方法
2.2.2.1 薄层层析法
2.2.2.2 高效液相色谱法
2.2.2.3 脂肪酶蛋白含量的测定
2.2.3 高区域选择性脂肪酶的筛选
2.2.3.1 1,3-甘油二酯酰基迁移的研究
2.2.3.2 脂肪酶的筛选
2.2.4 脂肪酶的固定化
2.2.4.1 纳米四氧化三铁的制备
2.2.4.2 纳米四氧化三铁的表面修饰
2.2.4.3 纳米四氧化三铁的表征
2.2.4.4 脂肪酶的固定化
2.2.4.5 脂肪酶活力的测定
2.2.5 固定化脂肪酶的酶学性质研究
2.2.5.1 pH对脂肪酶活力的影响
2.2.5.2 游离酶和固定化酶的底物特异性
2.2.5.3 游离酶和固定化酶的热稳定性
2.2.5.4 游离酶和固定化酶的动力学性质研究
2.3 结果与讨论
2.3.1 不同温度下1,3-甘油二酯的酰基迁移
2.3.2 脂肪酶的筛选
2.3.3 脂肪酶ROL催化的油酸甘油的酯化反应
2.3.4 四氧化三铁载体的制备与表征
2.3.4.1 场发射透射电子显微镜(TEM)分析
2.3.4.2 傅利叶红外光谱(FT-IR)分析
2.3.4.3 X射线多晶衍射仪分析(XRD)分析
2.3.4.4 磁学性质分析
2.3.5 脂肪酶ROL的固定化
2.3.5.1 表面活性剂等添加剂对固定化的影响
2.3.5.2 pH对固定化的影响
2.3.5.3 蛋白质浓度对固定化的影响
2.3.5.4 蔗糖酯添加量对固定化的影响
2.3.5.5 固定化时间对固定化的影响
2.3.6 固定化酶和游离酶的性质比较
2.3.6.1 pH对游离酶和固定化酶比活力的影响
2.3.6.2 固定化酶和游离酶的底物特异性比较
2.3.6.3 固定化酶和游离酶的热稳定性比较
2.3.6.4 固定化酶和游离酶的水解动力学研究
2.4 本章小结
第三章 固定化脂肪酶催化制备高纯度1,3-二油酸甘油酯
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 反应装置的设计
3.2.3 固定化脂肪酶催化制备1,3-二油酸甘油酯的单因素优化
3.2.4 固定化酶的重复利用
3.2.5 反应产物的分离纯化
3.2.5.1 甲醇结晶法
3.2.5.2 乙醇结晶法
3.2.5.3 碱中和法
3.3 结果与讨论
3.3.1 Fe3O4固定化酶制备高纯度1,3-二油酸甘油酯
3.3.1.1 不同摩尔比的油酸甘油对酯化反应的影响
3.3.1.2 温度对酯化反应的影响
3.3.1.3 固定化酶的添加量对酯化反应的影响
3.3.1.4 除水方式对酯化反应的影响
3.3.1.5 反应体系真空度对酯化反应的影响
3.3.1.6 搅拌速度对反应的影响
3.3.1.7 游离酶和固定化酶酯化效果的比较
3.3.2 游离酶和固定化酶的重复利用性能
3.3.3 酯化产物的分离纯化
3.3.3.1 结晶法
3.3.3.2 碱中和法
3.4 本章小结
第四章 脂肪酶ROL在毕赤酵母中的异源表达
4.1 前言
4.2 材料和方法
4.2.1 质粒和菌种
4.2.2 试剂和试剂盒
4.2.3 试剂的配制
4.2.4 培养基的配制
4.2.5 实验方法
4.2.5.1 基因的获取和密码子优化
4.2.5.2 重组质粒的构建和大肠杆菌的转化
4.2.5.3 线性化质粒的准备
4.2.5.4 毕赤酵母感受态的制备
4.2.5.5 毕赤酵母的电转化及筛选
4.2.5.6 毕赤酵母重组子的验证
4.2.5.7 重组毕赤酵母的诱导表达
4.2.5.8 毕赤酵母发酵液的酶活力测定
4.2.5.9 SDS-PAGE蛋白电泳检测
4.2.5.10 重组脂肪酶的区域选择性测定
4.2.5.11 重组脂肪酶的性质研究
4.3 结果与讨论
4.3.1 密码子的优化结果
4.3.2 重组质粒的构建
4.3.3 毕赤酵母的电转化结果
4.3.4 脂肪酶ROL的异源表达结果
4.3.5 重组脂肪酶ROL催化的区域选择性
4.3.6 脂肪酶ProROL的性质研究
4.3.6.1 脂肪酶ProROL的最适反应pH
4.3.6.2 脂肪酶ProROL的最适反应温度
4.3.6.3 脂肪酶ProROL的热稳定性
4.3.6.4 脂肪酶ProROL的溶剂耐受性
4.4 本章小结
第五章 脂肪酶ROL的热稳定性改造及表达强化
5.1 前言
5.2 材料和方法
5.2.1 质粒和菌种
5.2.2 试剂和试剂盒
5.2.3 试剂的配制
5.2.4 培养基的配制
5.2.5 实验方法
5.2.5.1 多序列比对
5.2.5.2 二硫键的设计
5.2.5.3 突变方法
5.2.5.4 重组大肠杆菌的构建
5.2.5.5 重组毕赤酵母的构建及高拷贝重组子的筛选
5.2.5.6 脂肪酶ROL的诱导表达
5.2.5.7 酶的热稳定性等性质的测定
5.2.5.8 突变体的同源建模
5.2.5.9 脂肪酶ROL及其突变体的分子动力学(MD)模拟
5.2.5.10 热稳定性强化的突变体的应用初探
5.3 结果和讨论
5.3.1 多序列比对结果
5.3.2 基于同源建模的理论分析
5.3.3 二硫键的理性设计
5.3.4 ProROL和E190C/E238C在分子水平上的构象变化
5.3.5 通过热点和二硫键的组合突变提高热稳定性
5.3.6 四点组合突变体热稳定性提高的机理解释
5.3.7 四点突变体的酶学性质
5.3.7.1 最适pH
5.3.7.2 最适反应温度
5.3.7.3 溶剂耐受性
5.3.7.4 动力学常数
5.3.8 四点突变体高拷贝转化子的筛选和诱导表达
5.3.8.1 高拷贝转化子的筛选
5.3.8.2 不同拷贝数的转化子的诱导表达
5.3.9 四点突变体的固定化和应用初探
5.3.9.1 四点突变体(V209L/D262G/E190C/E238C)的固定化
5.3.9.2 四点突变体及其固定化酶的应用
5.4 本章小结
第六章 脂肪酶ROL的区域选择性机制
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 口袋打开的脂肪酶结构的同源建模
6.2.2 蛋白和配体文件的准备
6.2.3 蛋白质-配体的分子对接
6.2.4 蛋白质-配体的分子动力学(MD)模拟
6.2.5 分子动力学计算结果的分析
6.3 结果与讨论
6.3.1 脂肪酶ROL的同源建模
6.3.2 脂肪酶ROL的区域选择性机理解释
6.3.2.1 脂肪酶ROL与甘油二酯的分子对接
6.3.2.2 酶与甘油二酯复合物的分子动力学模拟结果
6.3.2.3 脂肪酶ROL与甘油单酯的对接
6.3.2.4 酶与甘油单酯复合物的分子动力学模拟结果
6.4 本章小结
第七章 总结与展望
7.1 总结
7.2 展望
参考文献
附录Ⅰ 根据毕赤酵母密码子偏好性做优化的脂肪酶ROL的基因序列
附录Ⅱ 脂肪酶ROL完整的氨基酸序列
附录Ⅲ 本论文所用的仪器设备列表
在学期间所取得的科研成果
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