大肠杆菌丙氨酸产生菌的构建及转录组分析

发布时间：2024-01-31 02:18

　　L-丙氨酸在医药及保健品、日化、食品及食品添加剂等行业有广泛的应用,因此,L-丙氨酸的高产菌株是市场迫切需要的。本实验室前期成功构建了丙氨酸产生菌MG1655-31(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaD),测得其L-丙氨酸产量高于野生型,这为本研究提供了研究依据。本研究以菌株MG1655-31作为出发菌株,利用CRISPR/Cas9技术,在染色体水平进行基因敲除与敲入,通过阻断其它竞争代谢途径、过表达外源高活性关键酶和丙氨酸外运蛋白等策略,初步构建了L-丙氨酸产生菌。结果显示:(1)CRISPR/Cas9作为一种广泛应用的基因编辑工具,能够对大肠杆菌基因组进行简便、高效、多位点的基因敲除与敲入;(2)多轮基因编辑得到的大肠杆菌菌株MG655-714(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaDΔfr dA::alaDΔadhE::alaEΔackA-pta)经22h摇瓶厌氧发酵L-丙氨酸产量由5.54mg/mL提升至15.01mg/mL;5L发酵罐48h厌氧发酵L-丙氨酸产量由7.37mg/mL提升至20.01mg/mL;(3)分别提取发酵过程中不同时间点的大肠杆菌K-12野生型菌...

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图2-4PCR结果

第二章大肠杆菌L-丙氨酸产生菌的构建19MMarker;A1-A4upHomologousarm;A5-A7alaD基因;B8-B11downHomologousarm;C12-C15上游同源臂与alaD连接;D16-D18DonorDNA;E19-E20pTargetF-sgR....

图2-5PCR结果

河北大学硕士学位论文20氨酸代谢相关途径中，frdA（延胡索酸还原酶基因）参与琥珀酸的合成，敲除frdA阻碍了琥珀酸的生物合成；丙酮酸在来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶（alaD）的作用下，进一步代谢生成L-丙氨酸。所以，敲除frdA同时敲入alaD有助于提高L-丙氨酸的产量....

图2-6PCR结果

河北大学硕士学位论文22MMarker;A1-A4upHomologousarm;A5-A8downHomologousarm;B9-B12DonorDNA;C13-C16pTargetF-sgRNA-ackA-pta;D1-D2野生型对照;D3-D5阳性克隆.2.5.6菌落PC....

图4-21RNA电泳图

第四章基因编辑菌株与野生型菌株转录组分析35MRNAMarker;1-3菌株E.coliK-12MG1655；4-6菌株MG1655-714RNA样品按照转录流程测序之后，将两菌株的转录文本数据进行整理、与参考基因组对比分析以及进行表达量分析之后，为筛选出差异基因，继续进行如下分....

本文编号：3890782