半理性设计改造氟乙酸脱卤酶RPA1163实现α-氟代羧酸的克级拆分
发布时间：2023-12-07 19:47
α-氟羧酸(α-fluorocarboxylic acids,FCAs)由于其固有的生物活性和作为构建更复杂药物分子的前体,受到了广泛的关注。目前合成手性α-氟取代的羧酸类化合物主要通过化学方法,然而传统的化学方法操作复杂,立体选择性差,金属催化剂的使用也容易造成环境污染等问题。近年来随着生物催化的发展,相对于化学催化,生物催化往往能在温和的条件下实现反应,具有绿色环保,催化效率高,对映选择性好等优点,因此发展生物催化的方法来制备这一类有机氟化物对于整个有机氟化学领域都是一个重要的推动。然而酶本身也具有热稳定性低,以及针对非天然底物催化效率低等特性,这些缺点严重阻碍了它们的广泛应用。而随着分子生物技术的发展,基因合成以及测序成本的降低,一系列的方法工具(基因挖掘,定向进化计算机辅助设计等等)也被开发出来,有效弥补了这些缺点,全面地推动了生物催化在有机化学领域的开发和利用。前期的工作中发现氟乙酸脱卤酶RPA1163可以特异催化(S)构型的α-氟代苯乙酸以及α-氟代苯丙酸脱氟水解生成对应的(R)构型的α-羟基苯乙酸以及α-羟基苯丙酸,具有手性拆分的潜在用途。但以前的研究主要集中在研究水解脱...
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 手性含氟有机化合物
1.1.1 手性含氟有机物研究的意义
1.1.2 手性含氟有机化合物的化学合成
1.2 生物催化
1.2.1 生物催化概述
1.2.2 生物催化剂的产生和发展
1.2.3 生物催化在有机合成中的发展
1.2.4 生物催化在有机合成中的优点
1.3 蛋白定向进化
1.3.1 蛋白定向进化的意义
1.3.2 蛋白定向进化的概念
1.3.3 蛋白定向进化的应用
1.4 氟乙酸脱卤酶
1.4.1 氟乙酸脱卤酶的研究背景
1.4.2 氟乙酸脱卤酶的研究进展
1.4.3 氟乙酸脱卤酶的催化机理
1.5 本论文的选题意义及主要内容
第二章 氟乙酸脱卤酶RPA1163动力学拆分α-氟代苯乙酸
2.1 引言
2.2 实验部分
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂
2.2.3 实验室常规操作
2.2.4 表达质粒的构建
2.2.5 探究酶的表达条件
2.2.6 蛋白RPA1163纯化
2.2.7 底物合成
2.2.8 活性测试
2.2.9 RPA1163稳定性研究
2.2.10 反应条件优化
2.2.11 反应进程
2.2.12 TON的计算
2.3 结果与讨论
2.3.1 表达质粒的构建
2.3.2 表达条件的优化
2.3.3 酶稳定性测试
2.3.4 反应条件优化
2.3.5 反应时间
2.3.6 拓展底物谱
2.4 .小结
第三章 半理性设计改造氟乙酸脱卤酶用于低活性α-氟代羧酸的不对称拆分
3.1 引言
3.2 实验部分
3.2.1 仪器
3.2.2 试剂
3.2.3 C-F键解离能测定
3.2.4 动力学数据测试
3.2.5 同位素动力学数据测试
3.2.6 QM/MM计算同位素效应
3.2.7 QM/MM计算能量差
3.2.8 哈米特图
3.2.9 对接
3.2.10 突变体的构建
3.2.11 突变体活性测试
3.2.12 分子动力学模拟
3.2.13 粘度动力学数据的测试
3.3 结果与讨论
3.3.1 C-F键解离能测定
3.3.2 动力学数据的测定
3.3.3 限速步的确定
3.3.4 半理性设计构建突变体
3.3.5 突变体动力学数据测试
3.3.6 QM/MM计算
3.3.7 分子动力学(MD)模拟
3.3.8 粘度动力学实验
3.4 小结
第四章 克级制备α-氟代羧酸和α-羟基酸
4.1 引言
4.2 实验部分
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂
4.2.3 氟乙酸脱卤酶RPA1163冻干粉的制备
4.2.4 总转化数(TON)的计算
4.2.5 突变体热稳定性实验
4.2.6 大量制备
4.2.7 (R)-2-氟代羧酸和(R)-2-羟基羧酸的分离
4.3 结果与讨论
4.3.1 总转化数(TON)的计算
4.3.2 突变体热稳定性
4.3.3 大量制备实验
4.3.4 (R)-3,5-二氟苯基-氟乙酸(2g)的结晶学细节
4.4 小结
结语
参考文献
附录
硕士期间发表的相关论文
致谢
本文编号：3870962
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 手性含氟有机化合物
1.1.1 手性含氟有机物研究的意义
1.1.2 手性含氟有机化合物的化学合成
1.2 生物催化
1.2.1 生物催化概述
1.2.2 生物催化剂的产生和发展
1.2.3 生物催化在有机合成中的发展
1.2.4 生物催化在有机合成中的优点
1.3 蛋白定向进化
1.3.1 蛋白定向进化的意义
1.3.2 蛋白定向进化的概念
1.3.3 蛋白定向进化的应用
1.4 氟乙酸脱卤酶
1.4.1 氟乙酸脱卤酶的研究背景
1.4.2 氟乙酸脱卤酶的研究进展
1.4.3 氟乙酸脱卤酶的催化机理
1.5 本论文的选题意义及主要内容
第二章 氟乙酸脱卤酶RPA1163动力学拆分α-氟代苯乙酸
2.1 引言
2.2 实验部分
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂
2.2.3 实验室常规操作
2.2.4 表达质粒的构建
2.2.5 探究酶的表达条件
2.2.6 蛋白RPA1163纯化
2.2.7 底物合成
2.2.8 活性测试
2.2.9 RPA1163稳定性研究
2.2.10 反应条件优化
2.2.11 反应进程
2.2.12 TON的计算
2.3 结果与讨论
2.3.1 表达质粒的构建
2.3.2 表达条件的优化
2.3.3 酶稳定性测试
2.3.4 反应条件优化
2.3.5 反应时间
2.3.6 拓展底物谱
2.4 .小结
第三章 半理性设计改造氟乙酸脱卤酶用于低活性α-氟代羧酸的不对称拆分
3.1 引言
3.2 实验部分
3.2.1 仪器
3.2.2 试剂
3.2.3 C-F键解离能测定
3.2.4 动力学数据测试
3.2.5 同位素动力学数据测试
3.2.6 QM/MM计算同位素效应
3.2.7 QM/MM计算能量差
3.2.8 哈米特图
3.2.9 对接
3.2.10 突变体的构建
3.2.11 突变体活性测试
3.2.12 分子动力学模拟
3.2.13 粘度动力学数据的测试
3.3 结果与讨论
3.3.1 C-F键解离能测定
3.3.2 动力学数据的测定
3.3.3 限速步的确定
3.3.4 半理性设计构建突变体
3.3.5 突变体动力学数据测试
3.3.6 QM/MM计算
3.3.7 分子动力学(MD)模拟
3.3.8 粘度动力学实验
3.4 小结
第四章 克级制备α-氟代羧酸和α-羟基酸
4.1 引言
4.2 实验部分
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂
4.2.3 氟乙酸脱卤酶RPA1163冻干粉的制备
4.2.4 总转化数(TON)的计算
4.2.5 突变体热稳定性实验
4.2.6 大量制备
4.2.7 (R)-2-氟代羧酸和(R)-2-羟基羧酸的分离
4.3 结果与讨论
4.3.1 总转化数(TON)的计算
4.3.2 突变体热稳定性
4.3.3 大量制备实验
4.3.4 (R)-3,5-二氟苯基-氟乙酸(2g)的结晶学细节
4.4 小结
结语
参考文献
附录
硕士期间发表的相关论文
致谢
本文编号：3870962
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3870962.html
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