喹啉反硝化降解反应器关键菌和关键降解基因的探究

发布时间：2020-04-14 23:21

【摘要】：焦化废水中,难降解物喹啉及其衍生物是常见的含氮杂环污染物,因其有毒性、潜在致癌、致突变,因此研究喹啉降解十分必要。在过去四十年间,好氧条件下的喹啉降解研究报道较多,多株降解菌诸如Pseudomonas sp.,Rhodococcus sp.,Comamonas sp.等被分离出,4种降解通路anthranilate途径和8-hydroxycoumarin途径、5,6-dihydroxy-2(1H)quinolinone途径、7,8-dihydroxy-2(1H)quinolino途径被研究者们发现。然而,关于喹啉在无氧和缺氧下的降解研究较少且不够深入。为探究厌氧/缺氧条件下的喹啉降解,实验室建立了一个已稳定运行多年的喹啉(唯一碳源)反硝化降解反应器。前期的工作表明,Thauera可能是该反应器中的功能优势菌,然而多次分离高丰度的Thauera菌株均未成功,分离出的3株Thauera能在除喹啉外的多种污染物为唯一的碳源生长(如吲哚、甲酚、二甲酚及苯酚等)。鉴于反硝化条件下喹啉关键菌和关键降解基因、代谢通路报道十分有限,我们改变思路,引入外界环境变量,试图改变这个较稳定的喹啉降解菌群,从而关联分析群落结构变化和功能变化以探究关键菌,并尝试利用最新的比较转录组学技术,探究厌氧喹啉降解基因和通路。本论文的第一部分,我们在批式培养中采用抗生素扰动反应器原始菌群,试图简化该较稳定的反应器微生物群落结构,通过分析功能与结构的变化,从而研究关键降解菌。实验设置链霉素组和对照组(不加抗生素)。与对照组相比,链霉素处理后,喹啉降解率不降反升,上升7.9%,达66.6%;硝态氮去除率依然较高,超过80%。经过对菌群16S rRNA基因V3-V4区的高通量测序,我们发现Thauera属对链霉素不耐受(低于检测限)。链霉素组在喹啉降解能力不降反升的情况下,得到的关键属水平菌是Pseudomonas,Achromobacter,Bosea等,说明了这个反硝化喹啉降解群落的功能冗余,反应器中一些不占优势的菌可能在抗生素重塑的菌群后成为关键功能菌。本论文的第二部分,为探究厌氧喹啉降解的关键基因及推测出可能的通路,将一个稳定运行多年的缺氧喹啉降解反应器生物膜(菌体)取出并在体外厌氧培养。分别设置2种底物即喹啉和2-羟基喹啉(大量文献表明不论是厌氧或好氧条件,2-羟基喹啉是喹啉降解的第一个产物)作为体外批式培养的唯一碳源,动态取样,结合菌体生长情况和喹啉/2-羟基喹啉去除情况取样,提取mRNA,反转录、宏转录组测序,在RNA水平上分析。试图通过同组不同时间、两组不同碳源的对比找到基因表达差异,尝试找到喹啉的降解相关基因。初步的分析结果表明,在添加喹啉后,很多基因受到诱导,如反硝化相关的基因、与芳香族化合物降解相关基因如酰基辅酶A脱氢酶(Acyl-CoA Dehydrogenase)基因以及抗氧化胁迫的氧化还原酶(Oxidoreductase)基因等表达量极显著提高。尤其需要注意的是抗氧化胁迫的氧化还原酶基因在多种反硝化细菌中都极显著地高表达,与无底物饥饿培养后的菌群相比较,该基因的表达高100倍以上。而喹啉诱导表达的基因的来源菌类型多样,大多为反硝化细菌,如Thauera、Aeromonas、Ralstonia、Burkholderia、Pseudomonas、Sphingobium、Achromobacter等属的细菌。高表达基因数最多的是Thauera属细菌,有近60个来自Thauera细菌的基因的表达量高于饥饿菌群表达量的2倍以上。来自Thauera属细菌的功能未知的基因Tmz1t_1458、Tmz1t_1262等在添加喹啉为碳源时表达量提高10-50倍,这些基因可能与喹啉的降解过程有关。综上所述,本研究通过高通量测序,在DNA和RNA两个水平上尝试对反硝化喹啉降解菌群进行探究。通过环境基因组学分析,一方面证明在一个稳定的降解菌群中,该反应器因特定抗生素造成的群落结构的改变并不会造成其降解功能的剧变,且通过链霉素富集Pseudomonas(OTU1),Achromobacter(OTU2),Brevundimonas(OTU12),Bosea(OTU24)等关键OTU,推测这些关键菌可能在喹啉反硝化降解中发挥关键作用,同时是该群落功能冗余的证据。另一方面,通过环境转录组学分析,在代谢通路(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库注释后,喹啉组基因表达提高的基因主要是编码胁迫蛋白的基因,包括编码过氧化物酶的基因,且抗氧化胁迫的氧化还原酶基因在多种反硝化细菌中都显著地高表达。同时发现喹啉组有55.78%的序列无法比对到KEGG数据库中,这暗示着这些序列可能是新基因,且与喹啉反硝化降解相关。
【图文】：

上海交通大学硕士学位论文第一章 绪论啉概述随着工业废水排放加重和人们对环保的重视，喹啉这种难降解污染物正日关注。世界各地的研究人员已在好氧条件下分离获得一批可降解喹啉的细，并进行了一些降解机理与实际应用的研究，但关于缺氧/厌氧喹啉降解研缺乏[1-3]。 喹啉简介喹啉（别名氮杂萘、苯并吡啶），是杂环芳香性有机物，是无色但有刺鼻气吸湿性液体，分子式为 C9H7N，摩尔质量是 129.16 g/mol，密度为 1.093 g/mL是 15℃，沸点为 238℃，分子结构如图 1-1。将喹啉暴露于光下，，会逐渐，并进一步变棕。喹啉微溶于水，但易溶于很多有机溶剂[4]。

图 1-2 喹啉化合物污染的天然和人为来源[4]Fig.1-2 Natural and anthropogenic sources of quinoline compounds contamination[4]表1-1 焦化废水中主要的有机污染物类别及含量[9]Table 1-1 Classification and percentage of organic compounds in coking wastewater[9]
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X784;X172

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本文编号：2627832