玫瑰花青苷合成相关糖基转移酶基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-04-01 12:33

【摘要】：玫瑰(Rosa rugosa)是蔷薇科蔷薇属多年生落叶性灌木,花型秀美,气味芬芳,形色俱佳,具有极高的观赏价值。玫瑰虽然品种繁多,但花色较少,粉红色和紫红色为主,白色品种较少,缺乏黄色、大红色、橙色和复色等品种。因此,当前育种科研人员的主要目标是对玫瑰花色进行改良和创新。花青苷与植物花色关系密切。花青苷(Anthocyanins)属于水溶性的纯天然色素,普遍存在于自然界中众多植物的茎、叶、花、果和种子等器官中,是由类黄酮生物合成途径中的花青苷生物合成途径来合成的,在玫瑰的花瓣呈色过程中占据主导作用。在花青苷生物合成途径中,虽然有许多基因已被报道与调控花青苷的形成有关,但关于糖基转移酶基因等下游结构基因的报道却很少,而花青苷的最终形成则取决于糖基转移酶的糖基化作用。糖基化对于提高花青苷在植物中的稳定性和溶解度方面起着非常重要的作用。目前,对于玫瑰花色形成机理的研究较为缺乏,因此研究糖基转移酶基因在花青苷生物合成过程中的功能和相应的分子机制,对于阐明玫瑰花瓣的呈色机理,进而创新和改良玫瑰花色具有重大意义。本研究主要以?紫枝?玫瑰(R.rugosa?Zizhi?)和山刺玫(R.davurica)作为试验材料,根据本实验室已测得的玫瑰转录组数据,利用RT-PCR的方法从?紫枝?玫瑰花瓣的cDNA中分离得到了2个糖基转移酶基因(RrGT1和RrGT2)的CDS全长序列;采用生物信息学分析的方法对目的基因的序列结构和理化性质方面进行了鉴定与分析;采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)技术,分析了2个糖基转移酶基因在?紫枝?玫瑰和山刺玫不同组织部位、不同开花时期花瓣中的表达情况;采用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术于大田条件下在?紫枝?玫瑰和山刺玫植株中分别沉默了2个糖基转移酶基因,验证其在花色形成中的功能;采用转基因技术将2个糖基转移酶基因分别稳定转化烟草,以验证其在不同物种中的生物功能;在得到转基因烟草植株后再次利用VIGS技术沉默转基因植株中的玫瑰糖基转移酶基因,在基因表达层面通过正反两个方向对2个糖基转移酶基因在花青苷生物合成过程中的功能进行更为深入的探究和验证。主要研究结论如下。1.以?紫枝?玫瑰花蕾期花瓣的cDNA为模板,首次克隆得到了两个糖基转移酶基因的CDS全长序列,即RrGT1,GeneBank登录号为MK034140,开放阅读框1161bp,编码386个氨基酸;RrGT2,GeneBank登录号为MK034141,开放阅读框1422 bp,编码473个氨基酸。2.两个糖基转移酶基因均含有由44个氨基酸残基构成的典型的PSPG结构域,且均属于GTB超级家族。RrGT1和RrGT2基因所编码蛋白的分子式分别为C_(1879)H_(2964)N_(494)O_(556)S_(14)和C_(2334)H_(3628)N_(602)O_(711)S_(18);两个糖基转移酶蛋白均以α-螺旋(α-helix)、随机卷曲(Random coil)为主,且均可以现有的糖基转移酶3D结构为模板构建3D模型;两个糖基转移酶蛋白均属于不稳定的酸性蛋白;二者均存在糖基化位点且含有众多的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域,属于非分泌型蛋白;两个糖基转移酶基因与其他物种中大部分同类基因亲缘关系都相对较远,推测其具有较高的物种特异性。3.RrGT1和RrGT2基因在?紫枝?玫瑰和山刺玫的5个开花时期和7个组织部位当中均有表达,且表达量差异明显。综合来看,RrGT1和RrGT2基因的表达可能是受发育调控的且具有一定的组织特异性,推测其与花青苷的生物合成有关。另外,因为二者在叶片中的高表达水平,推测其还与叶片中其它次生代谢产物的糖基化有关。4.病毒诱导基因沉默(VIGS)降低了?紫枝?玫瑰和山刺玫中内源RrGT1和RrGT2基因的转录本丰度。经VIGS处理之后,空病毒载体组和空白对照组的花色基本一致,而基因沉默组的花色明显变浅。而实时荧光定量PCR的检测结果发现,空病毒载体组和空白对照组中内源RrGT1和RrGT2基因的表达量基本一致,而基因沉默组中内源RrGT1和RrGT2基因的表达量则分别显著降低。花青苷代谢通路中RrGT1和RrGT2基因上游6个关键结构基因(RrCHS,RrCHI,RrF3H,RrF3’H,RrDFR和RrANS)在空白对照组、空病毒载体组和基因沉默组的相对表达量基本一致,无明显变化。由此推测,花色的变浅可能与内源RrGT1和RrGT2基因的转录后沉默有关。5.在?紫枝?玫瑰和山刺玫中均可检测到6种花青苷:Cy3G5G,Pg3G5G,Cy3G,Pn3G5G,Pg3G和Pn3G。在?紫枝?玫瑰中,Pn3G5G的含量最高,其次是Cy3G5G,而其余四种花青苷的含量都相对较低。经VIGS处理后,几种花青素含量明显降低。其中,Pn3G5G的含量下降最为显著,其次是Cy3G5G,其他几种花青苷的含量都有不同程度的下降,而没有检测到Pg3G的存在。而在山刺玫中,Cy3G5G的含量最高,其次是Cy3G,而其余四种花青苷的含量都相对较低。经VIGS处理后,几种花青素含量明显降低。其中,Cy3G5G的含量下降最为显著,其次是Cy3G,其他几种花青苷的含量都有不同程度的下降,而没有检测到Pn3G的存在。这也是首次探明了山刺玫的花色主要由Cy3G5G控制。6.RrGT1和RrGT2基因的过表达促进了烟草中花青苷的积累。与转化空表达载体组和空白对照组相比,转RrGT1和RrGT2基因烟草株系的花冠颜色明显加深。经检测发现,在烟草花冠中检测到的最主要的花青苷为矢车菊素糖苷,这与前人的研究结果一致。而与空白对照组和空表达载体组相比,转RrGT1和RrGT2基因烟草株系的花冠中,花青苷的含量明显增加。由此说明,RrGT1和RrGT2基因与烟草中花青苷的生物合成有关。7.病毒诱导RrGT1和RrGT2基因的沉默降低了转基因烟草花冠中花青苷的积累。对RrGT1和RrGT2基因的转基因烟草株系进行外源RrGT1和RrGT2基因的沉默后发现,与空白对照组和空病毒载体组相比,基因沉默组中的花冠颜色明显变浅,同时基因沉默组中RrGT1和RrGT2基因的表达量分别大幅下降,且基因沉默组中烟草花冠的花青苷含量明显降低。由此推测,RrGT1和RrGT2基因是直接影响花青苷生物合成的关键酶基因。
【图文】：

玫瑰花,生物合成,代谢途径,苷元

绝大部分会与单糖相结合形成糖苷，称为花青苷（赵宇瑛和张汉锋，2005；Ge et al.,2012）。由于花青苷中糖基的数目、糖的结构以及与糖苷相结合的有机酸的位置的不同，其种类也变得繁多（Araceli et al.，2009）。当前共有 600 多种花青苷已被分离得到，但它们基本皆由六种苷元为前体合成的，分别为：矢车菊素苷元（Cyanidin）、飞燕草素苷元（Delphinidin）、天竺葵素苷元（Pelargonidin）、芍药花素苷元（Peonidin）、矮牵牛素苷元（Petunidin）和锦葵素苷元（Malvidin）（戴思兰和洪艳，2016）。类黄酮类化合物是以苯丙氨酸作为前体，历经三个阶段的生物合成得到的。首先，苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化，合成 4-香豆酰 CoA；然后，，4-香豆酰 CoA 和丙二酰 CoA 被查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）和黄烷酮羟化酶（F3H）催化，合成黄烷酮和二氢黄酮醇；最终，上游产物被二氢黄酮醇还原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）催化，先形成无色的花青素，再形成有色的花青素，然后又被类黄酮糖基转移酶（3GT）催化形成能够稳定存在的有色花青苷（赵宇瑛和张汉锋，2005；侯夫云等，2009；贾赵东等，2014）。

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玫瑰花青苷合成相关糖基转移酶基因的克隆及功能分析2.6.4.1 确定大田条件下 VIGS 发生的最佳接种时期根据紫枝玫瑰和山刺玫的往年花期和现阶段抽枝发芽的生长情况以及最近一个周的天气预报，确定的接种日期为2018年3月中旬至4月中旬。具体时间为：接种日期的下午2点半至4点半。2.6.4.2 重组病毒载体的构建
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S685.12

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